刚竹毒蛾(Pantana phyllostachysae Chao)是福建省60多万hm²毛竹林的一种最主要害虫, 在毛竹产区发生危害日趋严重。据统计, 全省年均发生面积2万hm²左右, 大发生年份达4万hm²以上, 如1996年仅建瓯市发生刚竹毒蛾面积就达2.2万多hm², 毛竹严重受害时, 竹叶常被吃光, 状如火烧, 导致竹林翌年出笋减少, 成竹生长量下降, 甚至引起竹腔积水或竹干腐烂枯死, 给竹业生产造成巨大经济损失(陈顺立等, 1997; 福建省林业科学研究所, 1991)。长期以来, 由于菌厂技术力量有限, 缺乏对刚竹毒蛾球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株的定向筛选, 防治上采用马尾松毛虫(Dendrorimus punctatus)菌株生产的菌粉防治刚竹毒蛾, 致病力弱, 林间防治效果差, 未能及时控制刚竹毒蛾的猖獗危害, 往往导致刚竹毒蛾第1代和第2代暴发成灾, 不得不采取油烟剂或烟剂等化学防治措施急救, 并大量杀伤林内有益天敌, 还破坏竹林生态系统(蔡国贵, 1996)。许多研究表明白僵菌存在一定的寄主专化性(樊美珍等, 1986; 徐庆丰, 1988), 不同来源的白僵菌对寄主昆虫的毒力存在差异(刘世骐, 1979), 但至今在国内外尚未见到刚竹毒蛾白僵菌优良菌株筛选的报道。筛选出对刚竹毒蛾特异性强且毒力高的优良菌株是白僵菌生产和应用必须解决的研究课题。为了寻求经济、有效、便捷的刚竹毒蛾生物防治方法, 于1997~2000年, 对从三明市三元区、顺昌、邵武、建瓯等地毛竹林间采集到天然感染白僵菌的刚竹毒蛾僵虫蛹, 进行分离纯化培养, 选择典型8个菌株进行不同培养阶段生长性状、大量生产菌粉质量以及与选用的4个松毛虫菌株开展室内外一系列防治比较试验, 从中筛选出BP4和BP1两个刚竹毒蛾白僵菌优良菌株, 并将BP4菌株应用于林间大面积防治示范和大规模生产, 取得了良好的防治效果和经济、社会和生态效益。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 培养基

PDA+虫尸培养基:去皮马铃薯200 g、琼脂20 g、葡萄糖20 g、虫尸100 g (研磨成虫粉, 配制前用清水浸泡1 h, 再煮沸30 min, 多层纱布过滤), 水1 000 mL, 按常规方法制备成。

1.1.2 菌株来源及其分离培养

将在三元、顺昌、邵武、建瓯毛竹林间采集到的天然僵虫和僵蛹进行组织分离纯化, 方法参照(李运帷, 1981)。培养基为PDA+虫尸(100 g), 获得典型纯培养菌株8个, 分别编号为BP1、BP2、BP3、BP4、BP5、BP6、BP7和BP8。

1.1.3 供试虫源

室内试验虫源从林间采回3~4龄健康刚竹毒蛾幼虫, 林间防治试验选择在刚竹毒蛾发生较重的毛竹林进行。

1.2 试验方法 1.2.1 菌落生长性状观察

应用直径为9 cm的培养皿, 倾入10 mL PDA+虫尸培养基, 经高压灭菌后, 在无菌操作条件下, 在其上点接直接5 mm的菌块, 每菌株3个重复, 恒温25 ℃培养, 每天观察菌落生长情况、色泽、形态、产孢情况, 培养15 d时用油标卡尺测量菌落直径。

1.2.2 产孢时间测定

将8个不同菌株菌种同量点接于盛有10 mLPDA+虫尸培养基的培养皿(直径为9 cm)中, 接种后进行25℃恒温培养, 每菌株3个重复, 培养3 d后, 每隔2 h定期镜检观测各菌株培养菌落有无孢子产生, 记载产孢情况, 统计确定产孢时间。

1.2.3 产孢量测定

对培养15 d的菌落, 用直径为5 mm的打孔器在培养皿培养菌落核心至1/2处打孔取菌块, 然后移入三角瓶, 加0.5%吐温80和无菌水定量洗下, 充分振荡配成孢子悬液, 用血球计数板测算单位面积孢子含量。

1.2.4 发芽率测定

将培养基上培养15 d形成的孢子, 用7%麦皮煮出汁加1%葡萄糖液配制成孢子液, 采用摇床振荡培养发芽法, 室温控制在25℃左右, 每隔6 h检查孢子萌发情况, 培养24 h, 镜检测定孢子发芽率。

1.2.5 菌粉生产

选择生长性状表现优良的菌株在福清市林业局白僵菌厂应用固体双相发酵法进行生产, 生产出的菌粉进行含水率、含孢量和发芽率等质量指标测定比较, 检验方法参照《白僵菌菌粉》福建省地方标准(福建省标准计量局, 1991)方法, 所产菌粉供试验使用。

1.2.6 室内毒力测定

把PDA+虫尸培养基上培养15 d的孢子和大量生产的菌粉, 用清水稀释配成试验所用孢子液, 浓度分别为0.1×10⁷·mL^-1、1.0×10⁷·mL^-1和10×10⁷·mL^-1, 用喉头喷雾器对着毛竹枝叶和3~4龄刚竹毒蛾幼虫定量喷雾, 每菌株3个重复, 每个重复40条虫, 对照喷清水, 喷后移入铁纱养虫笼, 笼内用棉花保湿, 次日后, 每天更换新鲜竹叶, 3 d后统计幼虫死亡情况, 同时检出死虫, 将其保湿培养, 观察白僵菌感染情况, 统计幼虫死亡率和僵虫率, 并求算LT₅₀。

1.2.7 林间防治试验

选用室内测定毒力强且产孢量高的刚竹毒蛾菌株以及选择4个松毛虫菌株生产的菌粉, 加工成粉炮, 每个粉炮重125 g, 进行林间防治试验, 试验地选择在顺昌县岗下乡郭城村发生刚竹毒蛾较为严重的毛竹林进行。林分立竹量2 250株·hm^-2, 郁闭度0.6~0.7, 林地垦复清杂过, 卫生良好, 有虫株率100%, 平均虫口密度62.6条·株^-1, 最大虫口密度258条·株^-1, 试验采用随机区组排列, 各处理小区面积1 hm², 每hm²放30个粉炮, 小区间以山脊或隔离带隔开不同处理, 以减少相互影响, 3个重复, 并设对照。在各小区内为调查方便, 有代表性选取中小竹10株作为标准株, 放菌炮前调查虫口数, 样枝上幼虫用尼龙纱网进行套笼, 放菌炮后5 d内下了2次小雨, 分别于7 d、15 d和30 d调查样株上的活虫数及竹林下幼虫白僵情况, 统计不同时期幼虫死亡率、校正死亡率和僵虫率。

1.2.8 菌株应用生产菌粉质量和大面积防治示范效果检查

将筛选出的最具优良品质的BP4刚竹毒蛾优良菌株提供永安、宁化、连城、上杭、武夷山等菌厂应用大量生产防治刚竹毒蛾专用菌粉, 对生产的菌粉质量进行抽样检测, 并于春季应用菌粉或粉炮进行大面积防治, 同时对应用马尾松毛虫菌株BX1、Bj1菌粉进行生产性防治效果作比较, 在不同地区有代表性样地内, 选取10株标准株, 防治前检查毛竹上的活虫数和防治后20 d进行幼虫死亡情况调查, 统计防治效果。

2 结果与分析 2.1 培养性状比较

根据培养观察, 经分离纯化所得典型的8个刚竹毒蛾菌株在PDA+虫尸培养基上的菌落形态、色泽、生长速度、产孢时间、产孢量和发芽率等测定结果见表 1。

从表 1可以看出, 各菌株在同一培养基上的菌落色泽、形状差异不大, 但产孢时间、产孢量和发芽率有差异。通过对8个菌株试验结果进行差异显著性t检验分析(α=0.05, t_0.05=2.571表略), BP1、BP4、BP5、BP8菌株之间以及BP2、BP3、BP6、BP7菌株之间的产孢量和发芽率差异不显著, 其它各菌株间差异显著。尤以BP1、BP4菌株菌苔孢子层厚, 产孢量高, 产孢时间较其它菌株早, BP1和BP4菌株120 h就开始产孢, 菌落扩展能力强。BP4、BP1、BP8和BP5孢子平均发芽率高, 24 h孢子平均发芽率分别为98.9%、96.4%、96.2%和95.3%, 初步筛选出这4个菌株进一步进行扩大培养和毒力测定。

2.2 菌粉生产质量结果

按斜面试管种子→一级大米种子→二级液体种子→三级固体(表皮:谷壳为10:1)培养发酵工艺方法生产, 液固接种量为1:1, 4个菌株三级接种后, 菌丝覆盖料面时间为40~48 h, 116~120 h开始产孢, 7 d后, 簸箕内培养物发酵充分, 不成团不成块, 手触易散, 孢子粉较多, 培养15 d, 取样镜检测定菌粉含孢量和孢子发芽率, 测定结果见表 2。

从表 2可知, 选择4个菌株进行固体发酵培养生产的菌粉质量较好, 尤其以BP4菌株的平均含孢量最高, 达268.6×10⁸·g^-1, 24 h孢子平均发芽率最高, 达97.5%, BP1菌株菌粉质量次之; 说明通过扩大培养, 4个菌株的生长性状优良, 表现比较稳定, 并以BP4表现最佳。

2.3 室内毒力测定结果

在前面试验的基础上, 筛选4个产孢较好的菌株进行毒力测定, 并将其菌粉产品与已经筛选的4个较好的松毛虫菌株菌粉产品毒力进行比较, 测定结果分别见表 3和表 4。

从表 3可以看出, 供试的4个菌株3种浓度菌液对刚竹毒蛾幼虫都具有较强的毒力, 但菌株间的毒力有所差异。毒力测定结果经差异显著性t检验(α=0.05, t_0.05=2.571表略)分析, 显示出BP1与BP4、BP5与BP8菌株间毒力差异不显著。而BP1、BP4分别与BP5、BP8菌株间毒力差异显著, BP4菌株3种浓度菌液20 d对幼虫平均校正死亡率达95.9%, 为最高, BP1次之, 达95.0%, BP8居三, 达88.9%, BP5最低为88.2%。另从4个刚竹毒蛾菌株3种浓度的幼虫死亡机率值与时间的直线回归方程(略)分析, 求算出的LT₅₀值看, BP4LT₅₀值最小, 表明BP4菌株对刚竹毒蛾致死时间短, 致死速度最快, 进一步证明BP4毒力最强, 其它菌株毒力依次是BP1、BP8、BP5。同一菌株随菌液浓度加大, 幼虫死亡率提高, 从幼虫死亡机率值与不同浓度的回归方程分析(方程略), 也表明菌液浓度愈大, 幼虫死亡率愈高, 但同一菌株不同浓度菌液同期幼虫死亡率有差别, 到后期这种差别逐渐缩小, 表明菌株对刚竹毒蛾毒力较强, 另从幼虫死亡白僵统计情况看, BP4平均僵虫率最高为93.1%;BP1僵虫率为90%;BP5和BP8僵虫率分别为85%和86.9%。从僵虫率高低也可反映出菌株的毒力强弱, 表明BP4毒力最高, BP1次之。

从表 4不同寄主菌株菌粉产品毒力测定结果看, 不同寄主菌株的菌粉对刚竹毒蛾毒力也有较大差异, 试验结果经t检验(α=0.05, t_0.05=2.571, 表略)分析, 除BP1与BP4、BX1与Bj1, 以及BX2与Bj2菌株间毒力差异不显著外, 其它菌株之间毒力差异显著。从刚竹毒蛾分离的4个菌株菌粉产品配制成菌液浓度为10⁸·mL^-1对刚竹毒蛾毒力较强, 20 d幼虫校正死亡率均达到90%以上, 并以BP4毒力最强, 幼虫校正死亡率达97.3%, BP1居次, 幼虫死亡率达96.5%, 而应用BX1、BX2、Bj1、Bj2等4个松毛虫菌株生产的菌粉对刚竹毒蛾毒力较差, 幼虫校正死亡率平均为72.4%, 但这4个菌株室内对马尾松毛虫的毒杀效果平均达95.6% (蔡国贵, 1999), 这说明白僵菌菌株的专化性与分离寄主有明显的关系。从菌粉毒力测定僵虫率统计结果, BP4为94.2%最高, BP1为91.7%略低, BP5和BP8分别为86.7%和88.3%, 也呈现较强的毒力, 而4个松毛虫菌株菌粉僵虫率为56.2%~68.6%, 毒力较刚竹毒蛾菌株低。从数据统计分析所得回归方程, 求出LT₅₀值比较, 也可以看出各个菌株产品对刚竹毒蛾幼虫的毒力大小, BP4菌株LT₅₀值为最小, 表明致死速度快, 显示出BP4菌株较其它菌株毒力高; 从室内二次毒力测试结果看, 筛选出的刚竹毒蛾菌株经过扩大培养生产, 对幼虫的毒力没有明显降低, 表明菌株稳定性较强。

2.4 林间防治试验效果比较

林间防治试验后, 作者分别于7 d、15 d和30 d进行防治效果调查, 具体调查结果见表 5。

通过对表 5中8个菌株林间防治效果进行差异显著性t检验分析(t_0.05=2.571), 各菌株间防治效果差异显著情况与室内毒测的差异显著性情况相吻合。筛选的刚竹毒蛾4个菌株对刚竹毒蛾防治效果较好, 其中以BP4和BP1毒力强, 平均幼虫校正死亡率分别达到95.6%和92.4%, 在防治后7 d调查时, 已发现小区内毛竹林下有大量僵死幼虫, 僵虫率达90%以上, 显示幼虫死亡进入高峰期, 表现出较强的毒力。另外, 松毛虫菌株生产的菌粉对刚竹毒蛾防治效果较刚竹毒蛾菌株生产的菌粉效果差, BX1, BX2, Bj1, Bj2菌株小区平均防治效果分别为67.6%, 63.1%, 68.4%和59.4%, 4个菌株平均防治效果为64.7%, 而且调查期间处理区林下白僵虫较少, 平均僵虫率为58.3%, 表明松毛虫菌株对刚竹毒蛾致病力较弱, 防治效果较差。

2.5 生产应用示范效果

1998~2000年将室内外防治试验表现毒力强, 且产孢能力强的BP4菌株作为生产菌株提供有关菌厂进行大量生产, 将BP1菌株作为生产备用种。在生产期间, 深入菌厂调查, 3 a生产的菌粉每批质量较为稳定, 产孢量高, 并对永安、连城、宁化(客家)、上杭各厂菌粉抽样检测, 菌粉含孢量在219.6~280.3×10⁸·g^-1, 平均为238.7×10⁸·g^-1, 24 h平均孢子发芽率为96.2%。在春防季节, 分别对永安、三元、宁化、顺昌、邵武、建瓯、沙县、龙岩、连城等9个县(市、区)应用BP4菌株生产的菌粉, 防治越冬代刚竹毒蛾面积达6.2万hm², 1999年调查28块标准地, 防治效果为90.2%~93.6%, 平均为91.2%, 2000年, 调查33块, 防治效果为91.7%~94.3%, 平均为93.4%, 2a平均防治效果达92.3%, 防治后能及时有效地控制住刚竹毒蛾的危害和蔓延扩展, 并且防治区第1, 2代刚竹毒蛾没有发生, 取得了显著的经济、社会和生态效益。另对延平、武夷山、长汀、南靖等地应用马尾松毛虫BX1、Bj1菌株生产的菌粉防治刚竹毒蛾区进行效果检查, 共设20块标准地, 经统计, 2a防治效果为51.3%~63.8%, 平均为62.1%, 防治效果较差, 到第1、2代刚竹毒蛾虫口密度仍较大。根据林间大面积防治示范效果比较, 表明应用BP4菌株比松毛虫菌株生产的菌粉防治刚竹毒蛾效果好, 值得大面积推广应用。

3 小结与讨论

本研究一系列试验结果表明, 通过分离纯化自然筛选出产孢早, 产孢能力强, 生长速度快, 发芽率高, 对刚竹毒蛾毒力强的BP4菌株, 经大量生产和大面积防治应用取得了较好的防治效果和效益, 已作为福建省防治刚竹毒蛾的生产菌株, 适于进一步大力推广应用。试验还表明, 不同来源同一寄主分离所得菌株对刚竹毒蛾毒力强弱不同, 存在不同毒力类型的菌株。另外, 不同寄主白僵菌菌株对刚竹毒蛾毒力差异显著, 对不同寄主、不同条件下定向使用目的菌株(樊美珍等, 1986)将很有意义。因此应用白僵菌防治刚竹毒蛾, 选用从刚竹毒蛾僵虫蛹分离的菌株, 才能取得良好的防治效果。

刚竹毒蛾是福建省毛竹林的最主要害虫, 发生危害严重, 坚持以白僵菌为主进行生物防治, 可以避免大量使用化学农药, 利于保护竹林内有益天敌, 而且不污染环境, 可扩散流行, 达到持续有效控制害虫的目的。但防治时应充分掌握有利天气条件, 在春季开展防治, 有计划有重点抓好越冬代刚竹毒蛾3~4龄期的防治, 这是控制第1, 2代大发生的关键, 使白僵菌生物防治的社会、生态和经济效益得到充分发挥。

关于对筛选的BP4和BP1两个优良菌株的性状保持, 在菌株继代培养时, 必须应用活虫复壮, 并选用含蛋白胨和刚竹毒蛾虫尸粉培养基进行培养, 有利于保持其稳定性(蔡国贵等, 2001), 不利于菌株产生退化, 生产培养过程须不断探索调整最佳培养条件, 以使其优良性状充分表达。随着生物技术发展, 采取基因工程措施, 寻找毒力基因, 在稳定性菌株中将其克隆并使之表达, 生产出所谓“超级”菌株(李增智, 1991), 是今后优良菌株选育的重要技术措施, 对BP4菌株的生物学特性及其应用于工业化生产的最佳技术参数, 有待于今后进一步试验研究。