干旱是农业中经常存在的问题。由水分亏缺造成的植物生长减少和作物减产超过了其它逆境因素造成的植物生长减少和作物减产的总和。目前有关植物抗旱生理生化机制的研究大多集中于小麦、玉米、高梁等农作物, 在木本果树上研究相对较少。近年来, 我国果树发展很快, 面积大幅度提高。为了不与粮食作物争地, 果树上山下滩已是方向, 山地栽培果树, 水分是获得高产优质的主要限制因子之一, 因此有必要研究水分胁迫下果树的生理生化变化。荔枝为亚热带名优佳果, 原产我国, 我国的栽培面积和产量均居世界之首, 它虽适应于山地栽培, 但常受到土壤缺水的影响。对水分胁迫下荔枝叶片氮代谢、核酸代谢和内源激素含量及各细胞器中Na⁺-K⁺ATPase活性的变化已进行了研究(陈立松等, 1998; 1999a;1999b)。在此基础上, 研究了水分胁迫对抗旱性不同的荔枝品种叶片呼吸代谢有关酶活性的影响, 为抗旱品种的选育和山地高产优质栽培提供基础资料。

1 材料与方法 1.1 试验材料的培养

本试验在福建农林大学完成。试验材料为2 a生实生荔枝(Litchi chinensis Sonn.)幼苗, 品种为适应山地栽培的抗旱性较强的“东刘1号”和适应河边栽培的抗旱性较弱的“陈紫” (陈立松等, 1999a)。试验品种种植在花盆内, 花盆口径25 cm, 高20 cm, 内装冲积砂壤土5 kg, 每盆种植1株小苗, 每品种种植150盆, 定量供水, 以保持每盆供水和盆内土壤湿度的一致性。

1.2 试验处理

水分胁迫处理在7~9月进行。处理时每品种取36盆生长整齐一致有代表性的幼苗, 其中18盆停止浇水, 另18盆正常浇水作为对照。当植株出现中度缺水和严重缺水症状时, 分别取样进行测定。中度缺水和严重缺水按Hsiao (1973)的划分标准进行划分:叶片相对含水量(RWC)减低了10%~20%属中度缺水, 20%以上的属严重缺水。

1.3 取样方法

采样在早晨7:30~8:30进行, 试样均取自小苗顶端第2至第4片复叶(从上往下数), 叶龄约50 d。

1.4 叶片RWC和乙醇酸氧化酶活性的测定

按华东师范大学植物生理教研组(1980)的方法进行。

1.5 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)活性的测定

按欧阳光察(1985)的方法进行。

1.6 线粒体的提取与分离及有关酶活性的测定

线粒体的提取与分离按陈立松等(1988)的方法进行。线粒体细胞色素C还原酶(NADH-CCR)活性的测定按Kuroda等(1991a)的方法进行; Mg²⁺-ATPase和Ca²⁺-ATPase活性依李杨瑞(1987)的方法测定。用比色法(蔡武城等, 1982)测定无机磷的含量。

1.7 蛋白质含量的测定

按Bradford (1976)的方法进行。

2 结果与分析 2.1 水分胁迫对荔枝叶片RWC的影响

非水分胁迫下, 2个品种间叶片RWC差异不显著。水分胁迫下, 叶片RWC极显著下降, 且品种间差异明显, 抗旱性较强的“东刘1号”下降的幅度明显小于抗旱性较弱的“陈紫”。说明抗旱性较强的品种在水分胁迫下有较好的保水力。

2.2 水分胁迫下荔枝叶片G-6-PDH活性的变化

水分胁迫显著降低了荔枝叶片G-6-PDH的活性, 抗旱性较弱的“陈紫”下降的幅度明显大于抗旱性较强的“东刘1号” (表 2-a)。分析表明, 水分胁迫下G-6-PDH活性(y)的下降与RWC (x)的下降呈极显著正相关(y=0.128x-1.778, r=0.951^**, DF=4;^**:P=0.01, 下同), 因此可以认为, 水分胁迫下G-6-PDH活性的变化是反映荔枝品种抗旱性的生理指标之一。

2.3 水分胁迫下荔枝叶片线粒体NADH-CCR

水分胁迫下荔枝叶片NADH-CCR活性降低, 抗旱性较强的“东刘1号”下降的幅度小于抗旱性较弱的“陈紫” (表 2-b)。相关分析表明, 水分胁迫下NADH-CCR活性(y)降低与G-6-PDH活性(x)的降低呈极显著正相关(y=0.814x+4.647, r=0.980^**, DF=4)。

2.4 水分胁迫对荔枝叶片NADH-CCR活性/G-6-PDH活性比值的影响

水分胁迫下, 荔枝叶片NADH-CCR活性下降的幅度小于G-6-PDH活性下降的幅度, 因而NADH-CCR活性/G-6-PDH活性比值上升(表 2-a, b)。NADH-CCR活性/G-6-PDH活性比值的上升与品种的抗旱性有关, 抗旱性较强的“东刘1号”上升的幅度明显小于抗旱性较弱的“陈紫” (表 2-c)。

2.5 水分胁迫下荔枝叶片线粒体ATPase活性的变化

荔枝叶片线粒体膜结合酶Mg²⁺-ATPase和Ca²⁺-ATPase活性在水分胁迫下的变化如表 2-d所示。水分胁迫下荔枝叶片Ca²⁺-ATPase活性显著上升, 抗旱性较强的“东刘1号”上升的幅度明显高于抗旱性较弱的“陈紫”。在中度和严重水分胁迫下, “东刘1号”Ca²⁺-ATPase活性分别比对照上升了34.5%和64.6%, 而“陈紫”仅上升了6.6%和10.44%。Mg²⁺-ATPase活性(y)的变化动态与Ca²⁺-ATPase活性(x)的变化动态基本相似, 2种酶活性的变化呈极显著正相关(y=-0.010+0.461x, r=0.930^**, DF=4)。

2.6 水分胁迫下荔枝叶片乙醇酸氧化酶活性的变化

从表 2-e可知, 在水分胁迫下, 荔枝叶片乙醇酸氧化酶随水分胁迫程度的增加而减少, 抗旱性强的品种下降的幅度明显大于抗旱性弱的品种。在中度水分胁迫和严重水分胁迫下, 抗旱性较强的“东刘1号”, 乙醇酸氧化酶活性分别比对照下降了29.9%和51.9%, 而抗旱性较弱的“陈紫”仅下降10.1%和36.3%。

3 讨论

G-6-PDH是磷酸戊糖(PPP)途径的关键酶, 它催化葡萄糖-6-磷酸氧化为葡萄糖内酯, 再水解产生葡萄糖酸。其主要功能是提供NADPH, 满足植物体清除H₂O₂的需要(Kong et al., 1999; Kuroda et al., 1991a)。相关分析表明, 水分胁迫下荔枝叶片H₂O₂ (y₁)和MDA (y₂)含量的上升与G-6-PDH活性(x)的下降呈极显著负相关(y₁=359.040-29.249x, r=-0.928^**, DF=6;y₂=213.400-11.502x, r=0.974^**, DF=6) ¹⁾。因此认为, G-6-PDH活性的下降可能是导致H₂O₂的增加、膜脂过氧化加剧的主要原因之一(Kuroda et al., 1992)。此外, H₂O₂的累积可反过来抑制G-6-PDH的活性(Hossain et al., 1984), 进一步促进H₂O₂的累积。由于G-6-PDH活性下降, PPP途径可能减弱, 这与一般认为干旱胁迫引起PPP途径加强的结论不一致, 可能与本试验所用的材料及胁迫的程度有关。轻度胁迫是否引起荔枝叶片G-6-PDH活性和PPP途径增加还有待于研究。

1) 陈立松.荔枝对水分胁迫的生理生化反应与适用性.福建农业大学, 博士论文, 1997

呼吸链是H₂O₂产生的主要场所之一(Kuroda et al., 1992)。水分胁迫下, 荔枝叶片中与H₂O₂产生有关的呼吸链酶NADH-CCR活性下降的程度明显小于与活性氧清除有关的G-6-PDH活性的下降程度。因此认为, 水分胁迫下, H₂O₂的产生超过细胞的清除能力, 导致H₂O₂的增加可能是引起活性氧清除系统受损的主要原因之一(Kuroda et al., 1991b)。Kuroda等(1991b)把NADH-CCR活性/G-6-PDH活性比值[CCO活性(细胞色素C氧化酶) /G-6-PDH活性比值]称为细胞状态指数(index of cellular status), 用来表示植物细胞对氧化胁迫的敏感性, 所以又称为氧化指数(oxidizability index, OI)。相关分析表明, 水分胁迫下荔枝叶片H₂O₂ (y₁)和MDA (y₂)含量的上升与NADH-CCR活性/G-6-PDH活性(OI) (x)上升呈极显著正相关(y₁=154.510x-7.071, r=0.904^**, DF=6;y₂=62.923x+66.275, r=0.995^**, DF=6) ¹⁾。由此认为, 水分胁迫下荔枝叶片G-6-PDH和NADH-CCR活性的下降与H₂O₂含量的上升、膜脂过氧化的加剧有关。

乙醇酸氧化酶是一种非线粒体氧化酶, 存在于过氧化物酶体中, 主要参与光呼吸(薛应龙, 1987), 因此, 可以把乙醇酸氧化酶活性的大小作为衡量光呼吸大小的指标。Lawer等(1975; 1977)指出, 干旱或渗透胁迫引起向日葵叶片乙醇酸累积和光呼吸速率下降。水分胁迫下荔枝叶片乙醇酸氧化酶活性降低, 可能减少了光呼吸对同化产物的消耗, 有利于荔枝在水分胁迫下的生存。乙醇酸氧化酶能把乙醇氧化为乙醛酸, 并产生H₂O₂, 水分胁迫下, 乙醇酸氧化酶下降, 除了减少同化产物的消耗外, 还可减少光呼吸产生的H₂O₂。研究中发现, 水分胁迫下乙醇酸氧化酶活性下降快的抗旱性较强的“东刘1号”H₂O₂增加的幅度小于抗旱性较弱的“陈紫”1), 也与上述结果一致。

通常认为, 在水分胁迫下, 能够维持较高ATPase活性的品种, 其抗旱性也较高(陈立松等, 1998)。水分胁迫下, 植物能量代谢受到破坏, 氧化磷酸化降低, ATP含量减少(李勤报等, 1988)。Paljakoff-Mayber (1981)在甜菜干旱试验中证明, 叶片失水较多时, 叶绿体的光合磷酸化明显降低, 同时ATPase活力增加, 这可能是脱水引起叶绿体膜蛋白发生变化, 抑制了光合磷酸化作用而导致ATPase增加。据此推测, 水分胁迫下, 线粒体膜ATPase活性的上升可能是脱水引起线粒体膜蛋白发生变化, 抑制氧化磷酸化作用而引起的。Ca²⁺不仅是植物细胞生长发育的一种大量元素, 也是偶联胞外信号与细胞内生理生化反应的胞内第二信使, Ca²⁺作为胞内信使触发许多的细胞活动, 从而影响植物对外界环境的反应与适应性。水分胁迫下荔枝叶片线粒体膜Ca²⁺-ATPase活性的提高, 可能有利于维持线粒体膜上Ca²⁺的运输, 有利于抗旱。

上述结果表明, 水分胁迫下, 荔枝叶片中与呼吸代谢有关酶的活性发生显著变化, 且与品种的抗旱性关系密切, 其有关指标可作为荔枝品种抗旱性鉴定的参考依据。