山楂叶螨(Tetranychus viennensis Zacher)是北方果树上的重要害螨，在20世纪60年代初，它就已经对有机磷杀虫剂产生了抗药性和交互抗性(张昌辉等，1966)，此后，虽经多次更换不同类型药剂，如三氯杀螨砜，三氯杀螨醇，石硫合剂，杀虫脒等，但每种药剂的使用时间均只有3~5a(河北省昌黎果树研究所叶螨组，1977)，现已对各类型杀虫剂产生了抗性，且可能发展为交互抗性(史志诚，1996)，近年来，由于有机合成杀虫剂的一些缺点正在不断为人们所认识，因此寻找新型，高效，安全的杀螨剂已成为植保工作者的一个重要课题。从植物中开发这样的杀虫剂是其中一个重要的方面。

瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)，为瑞香科狼毒属植物，别名红狼毒、绵大戟、断肠草等，多年生草本，是我国草地危害较重的有毒植物之一，主要分布于我国东北、华北、西南及宁夏、甘肃、青海、西藏、内蒙古等地的高山向阳处草地，是重度退化草原的主要种群。狼毒的根可以制成杀虫剂，具有驱虫、杀蝇、灭蛆的效果，可用于防治农作物、饲料牧草上的害虫(刘芹轩，1966)。

本实验以山楂叶螨为防治对象，测定了瑞香狼毒不同溶剂提取物对它的生物活性，并进一步研究了氯仿提取物对其体内几种重要代谢酶活性的影响，旨在初步了解瑞香狼毒对山楂叶螨代谢活动的作用机制，为其开发利用提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 材料

瑞香狼毒根，来源于山西省大同地区金沙滩。试螨为山楂叶螨雌成螨，采自山西农业大学果园，于室内培养后(26℃±1℃)选取健康活泼、日龄及大小一致试螨进行实验。

1.2 方法 1.2.1 活性物质的提取

将瑞香狼毒根置于通风背阴处风干后用电动粉碎机粉碎，过60目筛。准确称取45 g根粉，分为3等份，用滤纸包好后置于索氏提取器中，分别用甲醇，氯仿，石油醚(均为分析纯)3种溶剂各100 mL，80℃连续抽提10 h后，将所得溶液浓缩至浸膏状备用；另称取15 g根粉用水作溶剂温浸提取，温度为50℃，时间为10 h。

1.2.2 生物活性测定

药液的配制：将不同提取物用少量无水乙醇将其完全溶解，加入一滴吐温80，再加入适量的水，分别配成不同浓度的溶液，浓度单位为mg·mL^-1(植物干粉的浓度)。

触杀活性测定：采用玻片法。用双面胶带纸将雌成螨背部向下粘于载玻片的一端，并在解剖镜下剔除死亡或受伤个体，保证每玻片叶螨数为20头，在药液中浸5 s后取出，用滤纸轻轻吸掉浮药，分别于12 h、24 h后观察其死亡情况，接触动者为活，不动者为死。每种试剂设5个浓度，每个浓度3个重复，对照为1%乙醇溶液。

内吸活性测定：把健康的新鲜苹果叶片的叶柄截去0.5 cm后插于药液中，72 h后取出，浮贴于装有1%琼脂胶的培养皿中，将雌成螨个体接于叶片上取食24 h、48 h后观察其死亡率。每一叶片接虫30头，每种试剂设5个浓度，每一浓度设3个重复，对照为1%乙醇溶液。

1.2.3 酶活性测定

将不同处理的试螨于不同时间制取酶液，参照《植物化学保护研究方法》(慕立义，1991)中有关方法进行酶活性测定。

蛋白酶活性测定：以酪蛋白为底物测定。

酶液制备：分别于触杀处理4，8，12，16，20，24 h和内吸处理8，16，24，32，40，48 h取雌成螨100头，加0.25 mL生理盐水在冰浴中匀浆后，10 000 r·min^-1，4℃下离心15 min，取上清液备用。

蛋白含量测定：取酶液0.1 mL加0.3 mL生理盐水与Follin-酚甲液2 mL混匀静置10 min后加Follin-乙液0.2 mL摇匀，在30℃水浴中反应30 min，于500 nm波长处比色，测定OD值。

蛋白酶活性测定：取制备好的酶液0.05 mL，在37℃水浴中预热3~5 min，加入预热到37℃的酪蛋白溶液1 mL，混匀后置于37℃水浴中加热15 min，加入3 mL10%三氯乙酸，混合后离心。取上清液1 mL，加5 mL 0.5M碳酸钠，1 mL Follin-酚试剂，在37℃水浴中显色15 min，用分光光度计于680 nm波长处测光密度值。从绘制好的标准曲线上查出对应的酪氨酸微克数，确定酶活力大小。

GSTs酶活性测试：酶液制备、蛋白含量测定同上。

GSTs酶活性测试：将66 mmol·L^-1磷酸缓冲液2.5 mL，50 mmol·L^-1 GSH 0.2 mL，0.03 mol·L^-1 CDNB 0.05 mL迅速混匀作为对比，将以上试剂再加0.1 mL制备好的酶液作为试样，在27℃下置于uv-300型分光光度计340 nm处，测定5 min内OD值变化。

酯酶及同功酶活性测试：用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定(陈长琨，1993)。

2 结果与分析 2.1 毒力测定结果

根据瑞香狼毒4种提取物的浓度对数值与山楂叶螨校正死亡率机率值分别求出毒力回归方程，结果见表 1、2。

瑞香狼毒提取物对山楂叶螨的雌成螨都有一定的触杀活性，其中氯仿、石油醚提取物触杀活性较高，用浓度为30 mg·mL^-1(植物干粉的浓度)溶液处理后，24 h死亡率均达到100%，12 h校正死亡率也分别为82%，87%；而在内吸处理中，甲醇、氯仿、石油醚提取物活性较高，用浓度为30 mg·mL^-1提取物(植物干粉的浓度)处理时，内吸24 h校正死亡率分别达到85%，100%，88%，杀螨效果显著。

2.2 对蛋白酶活性的影响

蛋白酶是生物体内的主要消化酶系，它的升高或降低将直接影响生物体对食物的吸收和利用。从图 1、2中可以看出，用瑞香狼毒氯仿提取物内吸处理山楂叶螨后，蛋白酶活性变化有先降低后升高再降低的趋势，其比活力值大于对照组，处理的山楂叶螨体内蛋白酶活性有所激活；触杀处理后，随时间的推移，蛋白酶比活力值与对照组相互交错，变化不显著，但在处理12 h后与对照组相比稍有下降的趋势，药剂处理24 h后蛋白酶比活力值显著下降。

2.3 对谷胱甘肽-S-转移酶活性的影响

谷胱甘肽-S-转移酶是许多生物体内重要的解毒酶系，尤其在有机磷杀虫剂的二甲基磷酸酯或二甲基硫代磷酸酯的解毒代谢中起重要作用。谷胱甘肽-S-转移酶也是螨类体内最活泼的解毒酶系之一。由图 3、4可以看出，用瑞香狼毒氯仿提取物内吸处理过的山楂叶螨谷胱甘肽-S-转移酶活性随时间推移有先上升后下降的趋势，其活性均大于对照组，特别在内吸处理16 h时，对照组活性只有处理组的61%。这说明该提取物对山楂叶螨体内的谷胱甘肽-S-转移酶有强烈激活作用。在触杀处理中，山楂叶螨体内的谷胱甘肽-S-转移酶活性也有随时间推移有先上升后下降的趋势，其变化规律与对照组相似，并且其比活力值大部分大于或接近于对照组，因此，在触杀处理中该提取物对山楂叶螨谷胱甘肽-S-转移酶也有一定的激活作用。

2.4 对酯酶同功酶活性影响

酯酶是生物体内的主要水解酶系，它通过催化水解反应，分解进入体内的外源有毒物质，包括杀虫剂。从图 5酯酶酶谱的变化中可以看出，用瑞香狼毒氯仿提取物内吸处理的螨与对照组螨相比，酯酶的酶带颜色略有加深，特别在内吸处理8，32，40 h后，E1明显加强，酯酶活性有所激活，增强了解毒作用。而在图 6中，用氯仿提取物触杀处理后，在处理12，16，20 h后，E2消失，酯酶活性受到了一定程度的控制。

3 讨论

瑞香狼毒的药用始见于《神农本草经》，后《中药大辞典》中也有记载，具有逐水祛痰，破积杀虫的功效；现代医学和中药学又发现其有抗肿瘤和抗HIV病毒活性(魏春雁，2001)，是一种极具潜在药用价值的传统中药。近年来人们也在注意其在害虫防治中的研究和应用，但大都集中于蔬菜和大田害虫，关于其对螨类的活性却未见报导。

从本实验的结果来看，瑞香狼毒的甲醇提取物，氯仿提取物，石油醚提取物对山楂叶螨均有较好的生物活性。通过狼毒氯仿提取物对山楂叶螨体内几种酶系的影响可以发现，狼毒氯仿提取物对几种代谢酶系统均有一定的作用。在内吸作用中，氯仿提取物对山楂叶螨体内蛋白酶、谷胱甘肽-S-转移酶及酯酶同功酶均有激活作用；而在触杀处理中，其对谷胱甘肽-S-转移酶有一定激活作用，对酯酶同功酶有一定的抑制作用。蛋白酶是生物体内主要的消化酶系，它活性的高低直接影响着生物对食物的吸收和利用，本实验中蛋白酶活性的增加，表明瑞香狼毒中含有不利于消化的物质，影响山楂叶螨对食物的正常消化。谷胱甘肽-S-转移酶和酯酶都是生物体内重要的解毒酶系，是山楂叶螨用来代谢外源有毒物质的重要途径，当外源有毒物质进入生物体后，会引起代谢酶活性的增高来加强代谢作用，对其进行分解，保证生物体的正常生理活动。在本实验中，瑞香狼毒中可能含有有毒物质，因此在内吸作用中导致代谢酶活性升高，但是在触杀作用中，酯酶的活性受到一定程度的抑制，值得进一步研究。

瑞香狼毒中的化学成份比较复杂，其中主要的活性物质为香豆素类、黄酮类、二萜类、木脂素类等，其中的黄酮类化合物如狼毒素、新狼毒素、异狼毒素等对高等动物有较高的毒性，但对山楂叶螨有生物活性的物质为黄酮类物质还是其它类物质，需进一步的分离提取和鉴定。