桉树组织培养是林木组织培养中研究最早、最多的一大类, 目前全世界已对60种桉树进行了组织培养技术的研究，选用的外植体包括胚、下胚轴、芽、茎尖、叶、根、花芽、花药、木瘤等，大都获得了再生植株，其中有12种建立了组织培养快速繁殖育苗体系(谢耀坚，2000；曹孜义，1996；Le Roux et al., 1994)。近年我国对雷林1号桉(欧阳权等，1981)、巨尾桉(曾练武等，1990)、刚果12号桉(周志坚，1989)、赤桉(邱运亮，1995；韩美丽等，1997)、尾叶桉(王米力等，1996)等组织培养均获得成功。

巨桉(Eucalyptus grandis)可作纸浆等短周期工业用材，全世界现有巨桉人工林200多万hm²，是栽培面积最大的一种桉树，也是我国近年引种表现优良的桉树之一(潘志刚，1994)，在长江流域各省均能安全越冬。桉树种子繁殖往往由于种源不清，质量不一，造林后个体分化大，林相参差不齐。通过组织培养快速繁殖可获得基因型一致的优质苗木，营造林相整齐的速生丰产林，以获得短周期经济效应。Silva等分别采用巨桉的下胚轴、叶、带芽茎段进行离体培养，并获得再生植株(Silva et al., 1994；Laine et al., 1994;Raghavan, 1986), 国内尚未见巨桉离体培养的有关报道。于1993~2000年对巨桉种子下胚轴及优树的带芽茎段的离体培养进行了系统研究，并成功地建立了快繁体系，可应用于工厂化育苗。

1 材料与方法 1.1 材料

在四川乐山、峨眉、夹江、青神、犍为、彭山等县5 a生成片巨桉人工林内，用小样地法选出优树64株，选择差为3.5个标准差，入选率1/10 000，截干后移植到采穗圃。待根系恢复、树冠充分发育后，选取长势旺盛的半木质化萌发枝，切取除顶芽外的第3~4轮带芽茎段，去掉叶片，留少许叶柄，剪成5~10 cm节段作为外植体。

1.2 试验方法 1.2.1 灭菌处理

外植体剪成1.0~1.5 cm带芽茎段，采用2次灭菌法，0.1%HgCl₂浸泡2 min，无菌水冲洗2次，0.1% HgCl₂浸泡3~4 min，无菌水冲洗5~6次。

1.2.2 初代培养

将已灭菌的外植体接种于启动培养基，暗培养7~10 d后转入光培养。启动培养选用①基本培养基(2/3MS、改良H、S)；②BA(0.5、1.0、2.0)；③NAA(0.01、0.05、0.1)，进行L₉(3⁴)正交试验，每个处理接种150个外植体，培养30 d统计出芽率(发生芽的外植体占无菌外植体总数的百分率, SFF)及出芽指数(发生芽的外植体上的平均出芽数，SFI)。

所有培养基中激素单位均为mg·L^-1(下同)，均加0.7%~0.8%琼脂；pH 5.8~6.0；培养温度为(24±4) ℃；光照12 h·d^-1；光照强度2 000 lx。

1.2.3 丛生芽诱导培养

初代培养30~40 d后，将新芽茎段转入继代培养基中，对基本培养基(MS、H、改良H、S)、BA(0.5、1.0、2.0、4.0)、KT(0.5、1.0、1.5、2.0)、NAA(0.01、0.05、0.1、0.5)及IBA(0.1、0.2、0.5、1.0)，进行L₁₆(4⁵)正交试验，每个处理接种新芽茎段20个，继代培养5代后统计月增殖倍数(每个茎段上丛生芽数/每个茎段上原有腋芽数/继代次数)及每个茎段上的有效苗(高2~4 cm生长健壮的小苗)数，继代时间30 d。在正交试验的结果上再进行单因素试验，找出最佳培养条件，每个处理接种新芽茎段40个。

1.2.4 有效苗诱导培养

将已继代15次的丛生芽置于有效苗诱导培养基S+ BA(0.5，1.0)+NAA 0.1+生物素(1, 2, 3)+蔗糖4%中，每个处理接种50块1 cm²左右的芽丛，继代3次并统计月增殖倍数(每块芽丛的丛芽数/芽丛的原有丛芽数/继代次数)及每块芽丛的有效苗数及有效苗均高。

1.2.5 生根培养

用于生根的芽丛则切割成5~8株的小丛，置于壮苗培养基MS(铁盐、有机物1.5倍)+蔗糖4%中培养20~30 d，取3 cm以上的有效苗切割转入添加①ABT生根粉1号(0.5、1.0、2.0)；②IBA(0.5、1.0、2.0)；③NAA(0.1、0.5、1. 0)的1/2MS+蔗糖2%的生根培养基中，以不添加激素的培养基为对照，培养30 d后统计生根率、平均根长、平均根数及生根时间(转入生根培养基到开始出根的天数)。

1.2.6 移栽

当小苗的根长至0.5~1.0 cm并有3~6条侧生根时，移栽至基质中，置于过渡性温室中培养，温度20~25℃，相对湿度80%。移栽基质：①园土1:河沙1；②蛭石；③蛭石1:珍珠岩1。

2 结果与分析 2.1 基本培养基的选择

根据有关文献和预备实验选用了MS、H、改良H(Modified H)、S等多种培养基。S培养基是在H及改良H的基础上研制的配方(见表 1)，主要是调整了铵态N与硝态N的比例，减少了CaCl₂，而补充了Ca(NO₃)₂，降低了Cl的含量，提高了Ca、P的含量，总无机盐含量约为MS的2/3。

2.2 芽器官的诱导

在外植体的木质化程度适中、灭菌适度、材料新鲜的状况下，初代培养10 d后，部分外植体节间开始膨大，15~20 d后相继出现1~3个新芽，而在接种前已抽出的小芽大多自行枯萎、脱落。30~40 d后，新芽可长至1.0~1.5 cm(见图版Ⅰ-1)。诱导出的新芽可以分为a、b、c 3种类型，a类新芽叶大，色绿，叶片舒展，长势旺盛，可以用于继代培养；b类新芽叶片较小，不舒展，长势较弱；c类新芽抽出后不久即开始从叶片表面及茎段切口处长出白色颗粒状或粉状愈伤组织，并导致叶片卷缩，逐渐萎蔫，甚至脱落。因此，b、c两类均不能作为继代材料，而予以淘汰。

从表 2的结果分析，2/3MS、改良H或S培养基均有较高的出芽率(40%~50%)，其中S培养基a型新芽的比例明显高于其它2种培养基，出芽指数随BA浓度增加而增加，BA1.0时a型新芽的比例较高，实验表明A₈(S+BA1.0+NAA0.05)有较高的出芽率, a型新芽的比例最高，是较适宜的启动培养基。

2.3 丛生苗的诱导

巨桉新芽茎段经5~6次继代培养后可以形成30~100个·cm^-2的丛生芽，据观察，丛生芽的发生有2种类型(谢耀坚，2000；曹孜义，1996), A型是腋芽发生型(见图版Ⅰ-2)，是由新芽节部四周诱导出多个不定芽而逐渐形成30~40株·cm^-2的丛生芽。这种类型的丛生芽的特点是月增殖率为3~5倍，小芽疏密适度，容易抽茎展叶，小苗表现为粗壮，直立，嫩叶及茎微红，叶片大小正常、展开后叶色深绿，可以得到较多有效苗。但继代10~ 15代后，较高BA浓度虽然可以保持原有的增殖倍数，但会出现一些不正常的生长现象。一种情况是丛生芽虽然也易伸长，但小苗表现为叶片变小、增厚、变脆，茎增粗呈枝状或匍匐状，应该予以淘汰。另一种情况是丛生苗虽能伸长至3 cm以上，但同时出现启动时出现过的叶愈伤组织，致使叶片卷曲，不能正常生长，也应该予以淘汰。B型是愈伤组织发生型(见图版Ⅰ-3)，愈伤组织是在继代培养中由新芽节间产生，这种愈伤组织一旦发生，只需一代则可以由0.3 cm²长至1 cm²左右、馒头状、半圆形的愈伤组织，并且整个愈伤组织表面均为绿色小颗粒，并逐渐分化出许多绿色小芽苗，十分密集，月增殖率可高达6~10倍，继代5~6次，1 cm²愈伤组织上有丛生小芽100个左右，高度大都在0.1~0.5 cm左右，呈微芽形式，不易伸长。但如果及时降低BA的浓度，减少增殖速度，并转入相应的有效苗的分化培养基，仍然可以得到较多的有效苗。

诱导丛生芽的L₁₆(4⁵)正交试验的结果表明，在基本培养基(改良H，S)上添加BA (0.5, 1.0)、NAA(0.01, 0.05)的培养基对巨桉丛生苗的诱导较为适宜。根据这个结果，进行了单因素试验，结果见表 3，试验表明：B₈(S+BA1.0+NAA0.05+蔗糖3%)使腋芽发生型丛生芽的增殖倍数最高，B₂(改良H+BA1.0+NAA0.01+蔗糖3%)使愈伤组织发生型丛生芽的增殖最高，这与从下胚轴愈伤组织诱导不定芽的结果较为一致(另文报导)。2种培养基对丛生芽伸长生长的影响有明显差异，采用S培养基则可以得到较多的有效苗。因此B 8是较适宜的丛生芽的诱导培养基。在试验中还发现，如果在长期继代培养中采用BA1.0+NA A0.05的激素组合，愈伤组织发生型丛生芽增加，有效苗数有下降的趋势。因此采用B₈只适宜在培养初期使用，以尽快得到丛生芽。以后视丛生芽的状况，进行相应的调整。

此外，在实验中发现，在相同的培养条件下如在B₈(S+BA1.0+NAA0.05+蔗糖3%)培养基中，腋芽月增殖倍数在2~6倍之间，有效苗数也从3到10株·cm^-2不等。表明在继代过程中2种途径产生的丛生芽的比例及增殖情况不仅受基本培养基、激素配比的影响，材料本身起源及生理状态也有较大影响。

2.4 有效苗的分化

巨桉离体培养应主要选择腋芽发生型丛生芽进行继代，一旦有愈伤组织丛生芽发生，及时降低BA浓度，控制增殖率。即丛生芽达到20~30个·cm^-2时，在每次继代培养中应采取逐步降低BA，保持月增殖率3~4倍。多次继代后，上述不正常的生长现象会相应增加。在试验中发现，培养基中添加生物素1~3 mg·L^-1, 对于有效苗的分化及减少异常生长有明显的效果。对此进行了研究，将已继代15次的丛生芽置于丛生苗继代培养基中，继代3次并统计，结果见表 4。

实验表明：降低BA浓度至0.5，月增殖率略有下降，但仍可保持在3~4倍，而有效苗数及苗高均明显提高。添加的生物素明显促进有效苗的分化，有效苗数增加2~4，有效苗高增加1 ~2 cm。生物素的添加量对有效苗数的影响不明显，而对苗高影响较为明显，因此在丛生苗继代培养中采用C₆(S+BA0.5+NAA0.1+生物素2.0+蔗糖4%)对有效苗的诱导有较好效果(见图版Ⅰ-4)。

2.5 壮苗及生根

将经过无激素培养基进行壮苗培养的丛生苗(见图版Ⅰ-5)，选取3 cm以上的有效苗切割转入生根培养基中, 生根情况见表 5。结果表明：添加3种激素的生根培养基对诱导生根均有明显效果(见图版Ⅰ-6)，生根率从10%提高到50%~80%，平均根数增加2~3条，平均根长增加1~1.5 cm。3种激素中ABT的效果最好，激素种类的不同水平也略有差异，其中D₂(1 /2MS+ABT1.0+蔗糖2%)生根率高，出根早，根系正常，有4~6条侧生根，移栽时容易成活(见图版Ⅰ-7)。试验表明生根培养除培养基外，有效苗的健壮和木质化程度与生根关系密切。粗壮、半木质化程度的小苗容易生根，根系质量好。因此在生根培养以前采用壮苗培养基MS(铁盐、有机物1.5倍)+蔗糖4%培养30 d，可以使小苗健壮、木质化程度提高，能明显提高生根率及移栽成活率。

2.6 移栽

生根苗在过渡性温室中培养1个月后，小苗可以长至15 cm左右，且根系发育完全，此时即可将小苗带土移至室外定植(见图版Ⅰ-8、9)，3种基质均有较好效果，成活率都在90%以上，但园土1:河沙1的成本较低，便于推广应用。

3 问题与讨论 3.1 巨桉基因型差异对组培的影响

巨桉离体培养过程中，常表现出本文报导的一些形态异常，类似情况在其它桉树如山桉、大桉、红花桉、刚尼桉、王桉中也有报导(Le roux et al., 1994；Bonga et al., 1988)。这些情况的产生，可能与树种本身的生物学特性有关，也可能与外植体的起源、生理、生殖潜力及对离体培养中各种条件的反应有关，其成因十分复杂，尚无定论，比如叶表面出现颗粒状愈伤组织，在本试验中，认为可能是由于外源激素引起的异常反应，但采用无激素培养基培养多代，多数情况下仍表现异常。

在实验中为解决这些异常现象，尝试过多种培养条件，发现巨桉表现正常与否与培养条件关系不大，而与其外植体来源有密切关系。因此认为材料本身的基因型差异决定了其是否适合离体培养，为此对适合离体培养的巨桉优良无性系进行了筛选，选用28个优树的茎段进行组织培养，根据不同外植体在启动、丛生苗发生、有效苗的诱导及壮苗生根等试管繁殖过程中的差异，从中筛选出适合于组织培养的3个试管无性系G20、G25、G32，筛选出来的试管无性系不仅增殖、分化表现较好，而且也不易出现异常形态(另文报道)。

3.2 组培苗的遗传稳定性

桉树的组织培养研究曾经历了2个阶段，前期主要采取愈伤组织诱导不定芽或胚状体成苗途径，据报道，该途径的组培苗变异大，造林后林分分化较大，并认为可能是诱导初期使用2，4-D导致的遗传变异(曾练武等，1990)，20世纪80年代后期至90年代，多数采用芽器官培养而获得相应的快速繁殖体系，并在生产中取得较大成功(曹孜义等，1996)。本研究中发现同一外植体芽器官在离体培养中即使不使用2，4-D，在经过10代以上继代培养后腋芽发生型丛生芽和愈伤组织发生型也往往是同时发生，而愈伤组织发生型组培苗被认为是有可能发生遗传变异，所以用于生产的丛生苗继代次数应控制10~15代之间为宜。

3.3 巨桉快繁体系与工厂化育苗

巨桉快繁体系建立后，以100瓶丛生苗进行中试试验，6个月后，除去污染损失(20%左右)，已达到3 000瓶以上，月增殖系数6~8倍，可以实现年产组培苗10万株以上，完全能满足工厂化育苗的要求。但是要实现大规模工厂化育苗，还有一些问题需要解决，首先是组培育苗的成本较高，其次由于外植体基因型的差异，要求对培养条件作出灵活的调整，这要求较高的技术水平。第三，组培苗的移栽条件较为严格，一般苗圃不易满足，因此可考虑试管外生根等措施降低育苗成本，简化操作程序，提高组培苗成活率。此外，从国内外的具体实践来看，采用以优树组培苗建立采穗圃，再进行扦插繁殖，即“以苗繁苗”的方式是满足大规模造林行之有效的途径。