落叶松属(Larix)包括树种多，是北半球温带和寒温带的重要用材树种。种子产量低和空粒是落叶松良种繁殖的制约因素，同时，在裸子植物种内及种间杂交中普遍存在个体间结实的差异。为解决裸子植物中普遍存在的这一问题，国内外做过大量工作，提出过许多解释。Kosinski (1986)认为在L. decidus中，自交是产生大量空粒种子的主要原因。王晓茹等(1989)对油松种子园胚珠败育和空粒的研究认为，胚珠败育是花粉量不足造成的，而自交是产生空粒的主要原因之一。Owens(1994)、Takaso(1994, 1996)、Tomlinson(1994)等对裸子植物授粉机制及受精前后的形态结构变化、代谢、生理生化等方面做了一些工作，提出裸子植物中和被子植物一样，在传粉后和受精前这一期间，存在花粉识别和选择作用，而且花粉选择是种子植物进化的主要动因之一(Haig et al., 1989)。

有关植物雌雄配子体之间的识别，是植物有性生殖过程中的核心问题之一，也是当前国际上重视的前沿课题。目前大量的工作集中在茄科、禾本科、十字花科等植物的自交不亲和机制的探索上(Cheung et al., 1995; Gray et al., 1991;李润植等, 1998；华志明，1999)。由于裸子植物有性生殖过程较长，雌配子体器官难于分离和操作，对它们配子体识别及受精作用的研究较少。雌雄配子体相互作用的机理还不清楚，一些关键问题尚没有解决。

20世纪70年代以来，在落叶松种内、种间杂交育种和杂种优势的利用上，有许多工作，主要集中在生长性状、材性、抗性和适应性以及杂种种子园的建立等方面(潘本立等，1992；王景章等，1980；杨书文等，1992；徐日明等，1997；张颂云等，1990；杜平等，1999；马常耕，1997；丁振芳等，1995)，结实习性方面的研究较少。在以往工作的基础上，进行了落叶松属部分种间杂交，及华北落叶松的自由授粉和自交等试验，重点研究种间及种内杂交的交配亲和性，并分析从传粉到受精期花粉和胚珠的相互作用。该项研究对了解裸子植物配子体识别和受精作用的机理, 以及提高种子产量和质量具有重要意义。

1 材料与方法 1.1 试验时间和地点

试验时间为1996~2000年。外业工作主要在河北省塞罕坝机械林场的阴河林场种子园、光沟种子园和孟滦林管局龙头山林场查字种子园进行。内业工作在北京林业大学完成。

1.2 种内和种间杂交

包括种间杂交、种内自由授粉、自交和混合授粉(油松和华北落叶松的花粉)的试验。

种间杂交包括华北落叶松(L. principis-rupprechetii)、日本落叶松(L. kaempferi)、兴安落叶松(L. gmelini)、长白落叶松(L. olgensis)，其中华北落叶松和日本落叶松为光沟和查字种子园的无性系，兴安落叶松为阴河林场场部种子园无性系，长白落叶松花粉由黑龙江省林科院提供。从种子园中挑选已进入正常开花结实期，生长健壮，干形、冠形良好的植株作为授粉母树，进行了华北落叶松×日本落叶松(简称华×日，下同)、日本落叶松×华北落叶松(日×华)、华北落叶松×长白落叶松(华×长)、华北落叶松×兴安落叶松(华×兴)、日本落叶松×兴安落叶松(日×兴)组合的种间杂交，华北和日本落叶松安排了种间和无性系间2个层次上的正反交，兴安和长白落叶松只作为父本进行单向交配。受花粉数量限制，兴安落叶松为3个系号的等量混合花粉。为减小试验误差和便于实施，母本系号相同的组合尽量安排在同一株母树的相同树冠方位上。

除进行落叶松属种间杂交外，还对华北落叶松的个别无性系用油松花粉、油松与华北落叶松混合花粉进行授粉试验，以确定在传粉期胚珠对花粉有无识别与选择作用。另选取部分华北和日本落叶松无性系进行自交和自由授粉的对比试验。

1.3 授粉技术与种子饱满率测定

花粉飞散前1周切取花枝，水培于室内温暖处，分号收集花粉，用于授粉试验。其中华北、日本和兴安落叶松均为新鲜花粉，长白落叶松的花粉为低温贮藏的花粉。采用全花期套袋隔离、针刺喷粉技术进行控制授粉。于花粉飞散前约1周去雄套袋，每个交配组合含60个袋。当雌球花进入最佳可授期，用针头刺入隔离袋，授粉，第2天重复1次，授粉半月后，用细目化纤防虫罩换下花粉隔离袋。自由授粉的雌球花于开花前套好防虫罩。9月中旬种子成熟时，连同防虫罩一起采回，分组调制种子。用X光摄相观测各组合种子的饱满率，每组合随机取100粒种子，重复1次。

1.4 组织化学的定位观察

定期采集从传粉到受精期不同交配组合的胚珠，FAA固定，石蜡包埋，切片厚度8 μm，高碘酸-锡夫试剂和考马斯亮蓝对染，以显示不同组织中淀粉和蛋白质的动态变化。

2 结果与分析 2.1 种间及种内杂交结实率的变异

1996年进行了华北落叶松与日本落叶松的正反交、华北落叶松与长白落叶松、华北落叶松与兴安落叶松的种间杂交。杂交后饱满种子率见表 1。华×日饱满种子率平均为44.5%，日×华的平均值为48.9%，大致相当，介于华北落叶松和日本落叶松自由授粉的饱满种子率(50.9%，35.8%)之间，其中日4×华1的组合可配性高达79.0%。可见以日本落叶松作母本与华北落叶松杂交，获得比华×日组合较高的可配性，选择利用潜力明显大于华×日组群。杂交试验表明，不同无性系间交配的结实情况不同，日4和华19结实较好，母本效应值分别为22.7和16.7。华北落叶松与长白落叶松杂交可配性平均值达68.8%，居各交配组群之首；华×兴饱满种子率平均为64.2%，较高，仅次于华×长组群。日×兴饱满种子率平均值只有23.7%，在所有交配组群中最低。以上结果显示，不同种之间的杂交在可配性方面存在较大的差异，这种差异是由受精前的花粉选择造成的，还是受精后胚胎败育造成的，需进一步研究。

2.2 自交衰退

对华北落叶松和日本落叶松部分无性系分别进行自由授粉和自交授粉的试验，结果见表 2。由表 2看出，虽然不同无性系的自交表现有一定差异，但自交衰退现象十分明显，其中华8、华10和日4自交饱满种子分别为1.0%、2.0%和2.5%，基本属于自交不孕无性系；华16自交亲和性最高，也只有20.0%，表明华北落叶松和日本落叶松存在严重的自交衰退现象。

经球果分析和种子X光摄相检测，除有种翅而无种粒的类型外，自交种子从外形上看，大小一致，具正常的种皮，但大部分为空粒。实体解剖这些种子，除少数为饱满种子外，绝大部分种皮内仅有一些膜状残余物，个别有部分雌配子体和胚，但发育不完全。显然，在传粉到受精期间，在胚珠中存在不亲和机制，造成花粉竞争和受精前选择，或使花粉不萌发，或花粉管生长受阻，或花粉管到达颈卵器，但不受精，导致大量空粒种子的产生。

既然落叶松种间的可配性存在一定的差异，且有明显的自交不育现象，为了解花粉识别与选择机理，研究了从花粉接受期到受精前花粉和胚珠彼此之间的相互作用。

2.3 不同交配体系花粉的接收

为研究传粉期花粉与胚珠间是否存在特异性反应，观察了不同交配方式花粉的接收动态，其中包括自由授粉、自交、异属间混合授粉。混合授粉花粉由华北落叶松和油松的花粉组成，因为油松花粉具有气囊，在形态上可以明显地区分出来。华北落叶松的授粉机制与其它松科植物有所不同，传粉期胚珠顶端无传粉滴，而由珠被顶端大裂片上的珠被毛粘附花粉(贾桂霞等，2001)。结果显示，自交和油松的花粉均能落在胚珠珠被顶端的珠被毛上，传粉后，珠被毛逐渐萎缩退化，与花粉接触的表面形成呈PAS正反应的粘性物质，并最后牢固地粘着花粉外壁。随珠被伸长，珠被毛内折，被其粘附的花粉一同进入珠孔道，这与华北落叶松自由授粉中观察到的情况相同。图版Ⅰ-1为油松花粉落在珠被毛上，并进入珠孔道。同时在一些胚珠内还观察到，在珠孔道顶端，珠被毛退化破碎形成的粘性物质表面还附有一些尘埃等非生物杂质(图版Ⅰ-2)。以上结果表明，虽然在花粉和珠被毛表面之间有一定的相互作用，但这种作用并不是特异性的，初步确定在传粉期胚珠的珠被毛表面不存在花粉识别和选择作用。

2.4 受精前花粉和胚珠的发育及蛋白质的变化

当珠被毛内折完成，珠孔道封闭，萎缩退化的珠被毛粘附花粉外壁，之后花粉脱去外壁，进入到珠孔道上部，并在此停留一段时间；而一些杂质和死花粉仍被粘附在珠孔顶端(图版Ⅰ-2)。传粉后3~4周左右，花粉复水膨胀，并逐渐向珠心移动。珠孔道两侧的珠被内层细胞具有浓厚的细胞质和丰富的多糖物质，从图版Ⅰ-3可以看出，珠孔道最内层细胞为典型的分泌细胞，具有乳突结构，分泌物质进入到珠孔道，这恰与珠孔道中花粉的迅速水合一致。

从雌球花进入可授期到传粉后2~3周，雌配子体从四分体发育到游离核阶段，这一时期胚珠增大，珠心向珠孔道增长，但珠心顶端保持完整。此时珠孔道中自由授粉和自交的花粉粒，在形态结构上看不到差异。传粉3~4周后，雌配子体游离核细胞化，在其顶端出现颈卵器原始细胞，并产生中央细胞。与此同时，珠心顶端细胞开始增大，液泡化，随后细胞破裂，使得珠心顶端变平或凹陷(图版Ⅰ-5)。破裂的珠心向珠孔道分泌液体，在珠心分泌物和珠被分泌物共同作用下，花粉从珠孔道向珠心移动，并最终到达珠心表面。花粉从珠孔道上部向珠心移动过程中，体积增大，形状从圆形变为椭圆形，内壁外层不规则溶解(图版Ⅰ-4)。

传粉6周后，珠心表面的花粉萌发，花粉管穿过珠心达到颈卵器的颈细胞上，然后穿过颈细胞，将雄配子释放到卵细胞(图版Ⅰ-7)。

含有油松花粉的胚珠，虽然油松花粉能达到珠心，但未观察到油松花粉萌发。表明胚珠在这一阶段具有识别和选择花粉的作用。

从组织化学切片看，从传粉到受精这一期间，胚珠中蛋白质的分布发生变化。传粉期除接受花粉的珠被顶端外，整个胚珠均含有大量的蛋白质(图版Ⅰ-6)，之后发生区域性变化，珠被中的蛋白质逐渐消失(图版Ⅰ-1)。当珠心顶端细胞开始退化时，胚珠中的蛋白质主要集中在珠心顶端的薄壁细胞和卵细胞中；而前者正是向珠孔道分泌液体、以及花粉管将要穿过的区域，受精后，这一部位的蛋白质减少消失(图版Ⅰ-5、7)。有关这些蛋白质在花粉萌发和受精时所起作用，以及是否参与花粉选择和识别，有待深入研究。

3 讨论 3.1 花粉和胚珠的相互作用

华北落叶松种子可区分为：饱满、有活力的种子；具种翅而无种粒，这是由于受精前败育造成的；空粒，即正常的种皮内为退化的内含物，由于没有授粉、败育的花粉、没有受精或受精后早期胚胎败育造成。由于胚珠败育和空粒，使华北落叶松种子园中的实际产量很低；种子败育同样是其它裸子植物种子园中产量偏低的主要原因，为解决这一问题，国内外都有不少工作，但主要集中在传粉至受精前后这一关键时刻。Kosinski(1986)对欧洲落叶松(L. occidentali)自由授粉后种子发育为空粒进行了观察研究，认为一般欧洲落叶松空粒种子数大于70%，其中17%没有授粉，9%是因为大孢子发育不良，17%为花粉失效，30%为自花授粉而使胚退化，认为松树群体中存有大量胚致死基因，自交可导致隐性胚致死基因的纯合，造成胚死亡，产生空粒。Owens, Molder (1979)也认为L. occidentalis是由于较高的自交率造成胚胎败育。王晓茹和沈熙环(1989)在对油松的研究中，认为造成油松空粒的主要原因是自交，且表现出一定的规律，即空粒率由树冠上层向下层递增，由开雄球花少的区域向开花多的递增。通过华北落叶松和日本落叶松自由和自交授粉的对比试验，可以认为空粒主要是由自交造成的。因为华北落叶松的雌雄球花经常相互混合着生，且无明显的雌雄异熟，花粉较大无气囊，受重力的作用较大，则在自由授粉条件下不可避免地造成部分自交，从而造成胚珠败育，产生空粒。基于这种情况，需研究自交败育的机制，并采取措施防止自交。

一些学者认为裸子植物与被子植物类似，花粉和胚珠间具有相互作用，同样存在花粉识别和选择系统。Villar等(1984)证明在日本落叶松珠被毛上酯酶的存在，提出酯酶的活动将导致花粉与珠被毛相互作用，类似于被子植物中花粉和柱头的相互作用。Said等(1989)证明日本落叶松的花粉复水后，释放蛋白质和酯酶。Owens等(1994)利用扫描电镜和透射电镜，观察L. occidentalis传粉后0~72 h花粉和珠被毛的变化，观察到与花粉接触的珠被毛顶端逐渐萎缩，最终与花粉外壁牢固地粘附在一起。这与我们观察到的情况一致，传粉时，珠被毛分泌粘性物质，使花粉粘附在其上。但我们的研究显示，传粉初期虽然花粉和珠被毛表面有相互作用，但并不是特异性的。这些证据说明在裸子植物中花粉和接受表面具有相互作用，并且随树种和传粉机制的变化而变化，但专一的识别机制目前还没有确定。

虽然传粉期不同交配方式的花粉(自交、油松花粉、落叶松和油松的混合花粉)均可进入到珠孔道，但进入胚珠的花粉并不立即萌发，一般在珠孔道停留约4周，此时珠心分泌液体，并充满珠孔道，经过这一特有的阶段后，花粉开始萌发并形成花粉管。蛋白质的组织化学研究表明，受精前胚珠蛋白质主要集中在珠心顶端(花粉管将要穿过的区域)和卵细胞中。另外，在对落叶松花粉进行人工培养促其萌发时，一般的培养基很难成功萌发，只有加入受精期的胚珠(传粉后5~6周)匀浆液，才会获得萌发的花粉。可见花粉与胚珠间确实存在一定的相互作用，彼此产生一系列生理生化反应。Aderkas等(1999)也观测到了落叶松中珠孔道分泌物的存在。Takaso等(1994)对花旗松(Pseudotsuga menziesii)受精前一系列的变化研究表明，从胚珠不同发育阶段产生的分泌物影响花粉萌发、花粉管生长及最终的受精。此外，华北落叶松和日本落叶松不同授粉方式结实情况显示，虽然自交表现在不同无性系间有一定的差异，但自交衰退现象相当明显，其中华8、华10和日4自交饱满种子率仅分别为1%、2%和2.5%，基本属于自交不育无性系。显然在落叶松中存在自交不亲和机制，但这种选择是如何发挥作用的，还需进一步研究。

3.2 自交不孕(或低孕)无性系的利用对策

虽然试验中的华8、华10和日4无性系基本上是自交不孕，但与华北落叶松各无性系杂交，均有相当高的结实率，饱满种子平均可达71.6%，最高组合日4×华1为79.0%(表 1)。华8也表现出种间杂交可配性高的特性，与长白落叶松各无性系杂交，饱满种子百分率平均为74. 8%，最高组合华8×长2为85.2%(表 1)。目前，子代测定已证实，日×华的杂交F₁代具有明显生长优势¹⁾。因此，利用这些自交不孕(或低孕)型无性系生产高纯度杂种种子，具有重要的生产实用价值。

1) 杨俊明.华北落叶松良种繁育技术及其遗传基础.北京林业大学博士论文, 1998:76~82.

为了免除去雄环节，直接从日本落叶松无性系上采收大量高纯度杂种，可以考虑利用日4无性系与若干个华北落叶松优良无性系营建一对多形式的种间杂交种子园；或利用若干类似日4的自交不孕(或低孕)无性系，各无性系间隔一定距离，与多个华北落叶松优良无性系建立多对多形式的杂交种子园；也可利用比较理想的亲本建立由2个无性系组成的一对一形式的杂交种子园。还可利用最理想的日本落叶松无性系建立单系种子园，这种单系种子园，由同一无性系的分株栽植而成，在最佳授粉时刻，用华北落叶松花粉进行开放式人工授粉。落叶松花粉易收集并可长期贮藏，在-18℃条件下可贮藏10a以上，并可将花粉稀释后使用。单系种子园无需担心花期不遇问题；可根据遗传测定信息和年份间花粉产量的变动，随时增减父本无性系，操作灵活；可避开高寒地区，将种子园建立在最适合日本落叶松生殖生长的地方，这将有利于保证种子遗传品质和产种规模。

图版说明

1~7均为经锡夫试剂和考马斯亮兰对染的光学显微照片,紫红色物质为可溶性碳水化合物,紫红色至紫黑色的颗粒为淀粉;蓝色为蛋白质。

图版Ⅰ-1.进入胚珠的油松花粉(箭头所示带气囊的小花粉)和华北落叶松花粉(大花粉);雌配子体为游离核时期,蛋白质主要集中在雌配子体的组织和靠近珠心的内层珠被细胞内,×165。图版Ⅰ-2.进入珠孔道的花粉及杂质(箭头),×165。图版Ⅰ-3.传粉3周后的珠孔道内层具乳突的细胞,×660。图版Ⅰ-4.传粉4周左右,停留在珠孔道中复水的花粉,花粉内壁外层不规则剥落,×660。图版Ⅰ-5.传粉4周左右的珠心和雌配子体,珠心顶端细胞程序化死亡,蛋白质主要集中在卵细胞及其上的珠心细胞中,×165。图版Ⅰ-6.传粉期的胚珠,蛋白质几乎分布于整个胚珠中(箭头),×66。图版Ⅰ-7.受精期的胚珠及珠心组织,珠心顶端只有少量的蛋白质,蛋白质主要分布在卵细胞中;箭头为精子,空心箭头为卵核,示精卵结合,×165。

Explanation of Plate

All pictures are light microphotographs stained with PAS and Coomassie brilliant blue.The purple materials represent soluble carbohydrate.Starch grains are granules with purplish-red and purplish-black color.Blue materials are protein.

PlateⅠ-1.The pollens of P.tabulaeformis (arrow,small pollens with saccates ) and of L.principis-rupprechetii(big one) entered into ovule canal.Female gametophyte is at free nuclear stage.Protein mainly distribute in the tissue of female gametophyte and cells of inner layers of integument near nucellus,×165. PlateⅠ-2.The pollens of L.principis-rupprechetii and other materials (arrow) entered into ovule canal,×165. PlateⅠ-3.The most inner cells of ovule canal with protuberances at about 3 weeks after pollination,×660. PlateⅠ-4.The re-hydrated pollens in the canal at about 4 weeks after pollin ation,outer layer of it peeling regularly,×660.PlateⅠ-5.At about 4 weeks of pollination,the tip cells of nucellus are broke,while protein is concentrate din the egg cells and nucellus cells above archegonia,×165.PlateⅠ-6.Protein distributed in whole ovule (arrow) except papillae at pollination stage,×66.P lateⅠ-7.At fertilization stage,protein mainly distribute in egg cells,showing sperm nucleus (arrow) moving to the egg nucleus (hollow arrow),×165.