板栗(Castanea mollissima)种子属于典型的顽拗性种子(recalcitrant seeds)。目前, 人们通常用保湿贮藏法延长其寿命, 以达到短期(几个月到几年)贮藏的目的(傅家瑞, 1991; 陈建勋等, 1999)。但尚无有关板栗种子种质长期贮存的成功报道。而超低温保存则被认为是保存顽拗性种质最有希望的途径(郑郁善等, 2001; 殷晓辉等, 1996; 陈礼光等, 2001)。然而超低温保存技术用于种子保存的试验为时尚短(陆旺金等, 1998), 目前研究对象多数是蔬菜、粮食种子, 在林木种子保存方面研究极少, 这给成功地应用于林木种子种质长期保存造成很大的困难。许多报道都认为在-196℃温度下, 保存种子时间的长短对种子的活力无显著影响(徐刚标等, 1998; 吴永杰等, 1999)。本文以板栗种子及其离体胚为对象, 研究超低温保存后其种子活力、脱氢酶活性和α-淀粉酶活性, 为板栗种子的超低温保存提供理论依据。

1 研究材料和方法 1.1 材料

研究材料是来自福建松溪的板栗种子, 在不伤及胚的前提下, 切取约5 mm×3 mm×3 mm的胚方, 制备离体胚。将种子和离体胚统称为保存材料。于种子成熟脱落后马上进行发芽率、发芽指数和活力指数测定, 并进行液态氮(LN₂)超低温保存试验。液态氮由南平化工厂提供。

1.2 方法

保存材料的水分调节保存材料相对含水量是根据《国际种子检验规程》 (ISTA编, 1999)测定。采用高温烘干法, 温度105℃, 烘干12 h。计算公式如下:ω₀= (鲜重-绝干重) /鲜重×100。保存材料各含水量梯度制备采用减重法来计算, 即在30℃烘干箱+硅胶条件下, 使种子失水至25%、20%、15%、10%、5%等各含水量梯度, 不失水的为原始含水量, 以不经液态氮处理的为对照(CK)。失水过程中经常更换硅胶, 然后将不同水分的种子置于密封铝盒中备用。计算公式如下:ω=100-[最初重量× (100-ω₀) ]/最后重量。

冷解冻程序  按L₁₈(6¹×3⁶)正交设计(洪伟, 1991), 采用有、无预处理方法对保存材料进行各种冷解冻程序处理。冷冻方式:快冻:; 缓冻:(5 d);慢冻:。解冻方式:快解:; 缓解:; 慢解:。按上述不同冷冻处理和解冻处理流程处理后, 然后进行种子发芽试验和脱氢酶活性测定。

种子发芽  参照《国际种子检验规程》的规定。各试验4个重复, 每重复50粒。计算出种子的发芽率、发芽指数和活力指数。发芽指数:GI=∑G_t/D_t, 式中, G_t为在时间t日的发芽数, D_t为相应的发芽日数。活力指数:VI=GI×L, 式中, L为幼根平均长度。

脱氢酶活性测定  TTC染色法(黄学林等, 1990)。取待测离体胚4个重复, 每重复25粒种子, 在45℃温水浸种24 h (以增强离体胚的呼吸强度, 使显色迅速)。取处理的种子或离体胚, 剥取种胚, 加10 mL 0.1% pH7.0 TTC-磷酸缓冲液, 加盖, 在37℃黑暗条件下保温染色6 h, 染色后, 倒出TTC溶液, 并用蒸馏水冲洗2~3次, 用滤纸吸去浮水。观察并记录样品的染色部位、程度和面积。按“TTC定位图形法”作种子生活力鉴定。再加丙酮及少许分析纯石英砂充分研磨, 用丙酮冲洗研钵2~3次, 合并洗涤液, 定容至10 mL, 摇匀, 4 000×g下离心10 min。取上清液测OD₄₉₀值, 从标准曲线中查出相应的还原态的TTC含量。脱氢酶活性以每10个种胚中含有还原生成三苯基甲䐶(TTCH)含量μg·mL^-1表示。

α-淀粉酶活性测定  I₂-KI显色法(黄学林等, 1990)。反应体系包括1 mL 1 mg·mL^-1淀粉溶液和1mL 0.01 mol·mL^-1 pH4.8醋酸反应缓冲液。剥取种胚, 用5 mL的醋酸研磨缓冲液匀浆, 然后将提取液放在70℃恒温水浴20 min, 在4 000×g下离心5 min, 研磨缓冲液定容至10 mL, 作为酶制剂。然后吸取酶制剂1 mL加入到反应体系中, 在37℃恒温水浴0, 5和10 min后, 再分别吸取反应混合液0.3 mL, 迅速加入1 mL显色剂和3 mL蒸馏水, 摇匀, 测OD₆₂₀ (0), OD₆₂₀ (5)和OD₆₂₀ (10)值。淀粉酶活性的大小用每10个种胚每min水解淀粉的mg数表示。

2 结果与分析 2.1 自然状态下和脱水过程中板栗种子的发芽率分析

对原始板栗种子和脱水过程中各含水梯度的种子进行发芽试验(图 1)。新采收的板栗种子的原始发芽率较高(76%), 发芽指数为1.6, 活力指数为7.2, 原始含水量为44.66%。板栗种子颗粒大, 水分含量高, 采收时若无适时处理, 经2~3 d后其种子发芽率很快大幅下降, 而且大部分种子表面出现发霉腐烂, 果肉变黑, 耐贮性很差。在板栗种子水分调节过程中, 随着种子失水程度的加大, 种子发芽率不断降低。这主要归因于板栗种子耐脱水性差, 在脱水过程中极易使活力弱的部分种子受到脱水伤害, 最终导致不能萌发或萌发困难。当种子含水量降到10%以下时, 种子发芽率很低。5%含水量的种子受到严重脱水伤害, 基本上已丧失了活力。

2.2 超低温保存对板栗种子发芽率的影响

按照L₁₈ (6¹×3²)正交设计, 将不同含水量板栗种子进行超低温保存试验。保存过程中, 对种子发芽率造成显著差异的影响因子是种子含水量, 其6个含水量平均值之间的最大差异为23%, 经方差分析, F=10.694 > F_0.01 (5, 8) =6.682, 表明各含水量之间差异达到极显著水平; 冷冻和解冻方式处理间差异未达到显著水平。可见, 种子含水量是板栗超低温保存的关键因素; 板栗种子较高的发芽率是在20%~25%含水量之间; 当种子含水量为20%时, 发芽率最高, 为25%。在冷冻方式中, 缓冻和慢冻之间发芽率接近。在解冻方式中, 快解与缓解发芽率较高。因此, 缓冻缓解组合方式有较高的平均发芽率(表 2)。

2.3 含水量对板栗离体胚脱氢酶活性的影响

板栗离体胚在30℃+硅胶条件下失水至各含水量过程中, 随含水量下降, 其TTCH含量不断降低, 即脱氢酶活性下降, 降幅不断增大。新采收的板栗种子胚, TTCH含量极高, 达68.69 μg·mL^-1, 脱氢酶活性强, 种子呼吸作用强烈, 同时也说明其内部的生理生化过程和代谢活动旺盛。取不同含水量的种子, 在室温裸露条件下放置8 d后, 各处理种子TTCH含量都大幅下降, 而且, 在种子含水量与外界空气含水量相平衡的作用下, 种子含水量由原始含水量61%降至8 d后的35%。不同处理的种子含水量越高, 劣变越快, 表现为TTCH含量降低越迅速(表 3)。

超低温保存后离体胚脱氢酶活性随含水量的变化而改变。原始含水量处理脱氢酶活性明显地降低, 可能是高含水量在降温过程中受到比较大的降温伤害。15%含水量以上的离体胚TTCH含量变化趋势与超低温贮藏前极其相似, 这说明超低温保存能够较好地保存与维持离体胚活力。15%含水量的离体胚TTCH含量最高, 达15.16 μg·mL^-1, 但与贮藏前的相比, TTCH含量稍微有些下降。10%~15%含水量的离体胚TTCH含量降幅最小, 最接近于贮藏前的水平, 在此含水量范围内离体胚经超低温保存对种子活力没有影响。10%以下的含水量离体胚的TTCH含量下降幅度较大。因此, 可以肯定的是, 15%~20%的含水量对板栗离体胚超低温保存较为适合, 比10%的TTCH含量有显著提高(表 3)。

将超低温保存后板栗离体胚, 结合防冻剂进行TTCH定量测定, 当其离体胚含水量≥10%时, TTCH含量变化极其平缓, 含量高且变幅很小, 都处于14~23 μg·mL^-1之间, 当含水量 < 10%时, TTCH含量急剧下降, 这说明, 防冻剂预处理对脱水伤害的修复影响较小, 但能使离体胚在冷冻过程和解冻过程中所造成的低温伤害降低到最小限度。防冻剂预处理后最佳的保存含水量为20%, TTCH含量最高。此外, 直接用原始含水量进行添加防冻剂超低温保存板栗离体胚, 其保存效果并非最佳(表 3)。

2.4 含水量对板栗离体胚和α-淀粉酶活性的影响

α-淀粉酶能在种子萌发初期, 将种子所贮藏的大分子营养物质分解成能直接吸收利用的小分子营养物质, 来满足种子萌发过程对营养物质和能量需求, 其活性的高低严重地影响种子萌发能力, 能够反映种子活力。在板栗离体胚保存过程中, 含水量对离体胚的α-淀粉酶活性保持也起着关键作用, 其极差最大, 为0.132 mg·min^-1; 原始含水量的板栗离体胚不能直接用于超低温保存, 否则会由于超低温保存时降温和升温的低温伤害造成α-淀粉酶活性极大下降, 其活性水平极低, 接近已遭遇严重脱水伤害的5%含水量时α-淀粉酶活性水平。有利于α-淀粉酶活性保持的含水量范围为10%~20%, 其α-淀粉酶活性均大于0.15 mg·min^-1, 其中20%含水量α-淀粉酶活性最大, 达到0.181 mg·min^-1。不同冷冻方式和解冻方式的α-淀粉酶活性差异接近, 其中在冷冻方式中, 保持板栗离体胚的α-淀粉酶活性能力大小排序为:缓冻 > 慢冻 > 快冻, 而解冻方式中则为:缓解 > 快解 > 慢解。最佳的各水平组合为:20%含水量+缓冻+缓解(表 4)。

3 结论与讨论

种子的超低温保存, 含水量高低以及脱水方法是关键因素。含水量过高会造成保存材料在冷冻和解冻过程中受到冻害甚至死亡, 过低又会造成脱水伤害影响其活力。若能最大限度地减少脱水伤害和降低含水量, 保存材料的活力就能得到最大限度的保持。正常种子超低温保存的最适含水量一般在9%以下, 有的含水量下限值达到2% (Stanwood, 1985), 仍能保持很高的发芽率。然而, 大多数顽拗性种子的保存其最低含水量下限通常较高, 在10%以上(郑郁善等, 2001; 陈礼光等, 2001; 2000)。

本研究表明, 板栗种子在脱水过程中, 由于其脱水耐性差, 导致种子发芽率不断下降, 直至生命力丧失。超低温保存后种子发芽率除了受种子含水量影响较大外, 其次是冷冻方式, 各种解冻方式之间差异较小, 20%含水量+缓冻组合能够得到较高的存活率。脱氢酶活性和α-淀粉酶活性研究结果也表明, 脱氢酶活性和α-淀粉酶活性越高, 种子的活力也越高, 超低温保存能够很好地维持种子活力。因此, 要想成功地进行板栗种子超低温保存, 对保存材料进行预降温到0~5℃处理是必需的, 特别是在离体胚添加防冻剂的超低温保存过程中, 因为这样处理能够对保存材料进行低温锻炼, 提高存活率。好的防冻剂组合能够降低保存材料的冰点温度, 缓和超低温保存冷冻伤害, 使其最佳保存含水量范围得到扩大。