白桦(Betula platyphylla)组培再生方面的研究起步较晚(陶静等, 1998a; 1998b;詹亚光等, 1998), 而在再生机理方面的研究尚属空白。本文对白桦不同外植体组织培养过程中愈伤组织的形成, 不定根、不定芽的发生, 以及愈伤组织内部器官分化等方面的发生过程进行了系统的解剖学观察, 以揭示离体再生机制。

1 材料和方法 1.1 材料的来源

白桦休眠芽来自强化种子园7 a生优树嫁接苗及优树1 a生实生苗。

1.2 培养方法

春季取休眠芽或展叶芽, 经表面消毒, 剥掉外层芽鳞, 仅剩2 mm大小的茎尖, 接入WPM+BA1.0 mg·L^-1+2%蔗糖的培养基中。接种后培养于23~25℃的培养室中, 每天光照16 h, 光强为1 500 lx。一个月后, 转入增殖培养基WPM+BA0.5 mg·L^-1+KT0.5 mg·L^-1+2%蔗糖; 从形成的无菌苗上取叶片、叶柄、茎段分别接入培养基IS+BA0.8 mg·L^-1+NAA0.2 mg·L^-1+2%蔗糖诱导愈伤组织和不定芽。每3~5 d取材固定(FAA固定12~24 h), 持续1个月, 观察愈伤组织的形成及不定芽的分化。将不定枝(带2~3片叶)接入NT (WPM) +BA1.0 mg·L^-1+2%蔗糖的培养基中。每3~5 d固定一次, 观察腋芽增殖过程。取3~5 cm高的不定枝接入生根培养基WPM+IBA0.2 mg·L^-1+2%蔗糖, 每2~3 d取枝基部1 cm长茎段固定, 方法同上, 直至根伸出为止。

1.3 制片

用石蜡切片法, 切片厚度10~12 μm。番红-固绿对染, 加拿大树胶封固。Olympus高级生物万能显微镜观察并照像。对部分培养材料进行了电镜扫描。

2 结果分析 2.1 白桦不同外植体愈伤组织的起源

白桦茎的愈伤组织起源:①白桦茎的解剖构造  白桦幼茎的横切面由层次分明的表皮(或周皮)、皮层、维管组织系统3部分组成(图版Ⅰ-1)。皮层薄壁细胞呈卵圆形, 排列疏松, 细胞间有较大的胞间隙。形成层的细胞较小, 细胞质浓, 染色较深, 由排列紧密的分生细胞组成。木质部主要由导管和木纤维组成。细胞排列紧密, 呈放射状, 长方形或卵圆形, 木质部中间隔着单层射线薄壁细胞。茎的中央部分是髓, 由幼嫩的薄壁细胞组成, 呈较规则的圆形, 细胞间隙不明显。通过对大量生根培养前的茎段进行解剖观察, 未见有先成根原基的存在, 这与白桦插穗生根的解剖学研究结论是一致的(林艳等, 1996)。②茎愈伤组织的发生  切片观察发现, 有分裂能力的分生细胞和薄壁细胞均能形成愈伤组织(如:切口处的皮层薄壁细胞、韧皮薄壁细胞、表皮、形成层及木栓形成层细胞、及其射线薄壁细胞)。最初主要是皮层薄壁细胞经过诱导, 脱分化回复胚性, 开始大量分裂形成愈伤组织(图版Ⅰ-2)。培养6 d后, 切口表面可见黄白色的愈伤组织。而后, 愈伤组织增殖较快, 9 d后, 从切片中可见愈伤组织块中有带状的分生组织产生, 带状分生组织向内外衍生的细胞作径向有规则的排列, 使愈伤组织体积增大(图版Ⅰ-2)。培养25 d后, 射线薄壁细胞和韧皮薄壁细胞等也启动形成了愈伤组织和小分生细胞团, 将木质部扯散, 失去了原有的完整性。

白桦叶片的愈伤组织的起源:①白桦叶片的解剖构造  含主脉的叶片横切面由表皮、叶肉和叶脉组成(图版Ⅰ-3)。表皮由单层细胞组成, 叶肉有明显的栅栏组织和海棉组织之分。上表皮下的栅栏组织细胞排列紧密, 呈长柱形。叶背海绵组织排列疏松。主脉中靠叶腹面的为木质部, 有明显的木射线。射线细胞长方形, 呈单列, 排列紧密。木质部下方是由圆形的细胞质浓厚的薄壁细胞组成的韧皮部。主脉背腹均有较大的皮层薄壁细胞, 背面有4~5层, 腹面2~3层。②叶片愈伤组织的发生  培养6 d后可见有愈伤组织从主脉的切口处生成。解剖观察可知, 表皮、皮层、射线薄壁细胞以及与之相邻接的栅栏组织细胞均启动分裂形成愈伤组织(图版Ⅰ-4)。邻近叶肉组织的射线薄壁细胞主要呈平周分裂, 细胞质浓, 核更大。表皮及皮层新生的细胞呈放射状排列, 在叶脉上形成愈伤组织。

叶柄愈伤组织的起源:①白桦叶柄的解剖构造  白桦叶柄主要由3部分组成(图版Ⅰ-5) :表皮、皮层和维管组织。表皮为单层的薄壁细胞, 其上分布着表皮毛。叶柄横切面大部分由皮层薄壁细胞占据, 细胞大而圆, 高度液泡化, 紧挨表皮的2层皮层薄壁细胞含有较多的淀粉粒。维管柱呈扇形分布, 外侧是细胞质浓厚的韧皮部, 里面依次为木质部和髓, 形成层细胞不明显。②白桦叶柄的愈伤组织的发生  培养6~10 d, 叶柄断口出现豆粒大的黄绿色愈伤组织。这些愈伤组织主要由外皮层薄壁细胞脱分化大量分裂产生(图版Ⅰ-6)。内部的维管束虽未参与愈伤组织的形成, 但形成层细胞启动, 分裂成排列整齐而紧密的多层分生细胞群(图版Ⅰ-7)。

2.2 愈伤组织内部的器官分化

愈伤组织分化:培养12 d后, 茎段切口形成球形的愈伤组织块。从纵切面可以看到几种形态结构有一定差别的细胞群。一种是产生在愈伤组织的周缘部位, 细胞近方形, 细胞壁较厚, 核不明显, 呈带状有规则排列的木栓化细胞(图版Ⅰ-8); 另一种是出现在愈伤组织内部或近表层, 细胞质稠密、无液泡、细胞核大的呈团状分布的分生小细胞群(图版Ⅰ-9), 称作分生组织结节。木栓化细胞的产生是由于愈伤组织近表面的几层薄壁细胞恢复分生能力, 形成类似木栓形成层的结构, 向外分化木栓层, 向内分化栓内层, 因此在愈伤组织外围形成了一些木栓化的区域, 其形成方式类似于周皮。这些木栓化细胞所在区域的愈伤组织中, 细胞分裂不再占优势, 内部开始分化, 外层愈伤组织的增殖主要从木栓化薄弱的区域向外扩展(图版Ⅰ-8)。第2种类型的细胞分生组织结节的产生, 通常是由于愈伤组织内单个薄壁细胞启动, 恢复分生能力, 反复分裂形成的(图版Ⅱ-1)。这种分生细胞团在愈伤组织内部通常分化成维管组织结节, 在形成的初期, 细胞质浓厚的分生细胞纵向伸长, 螺旋状缠绕成一团, 同周围的细胞自然地形成明显的界线。这种维管组织结节细胞的分裂方式常表现出单极性的分裂倾向。维管组织结节进一步的发展可能出现2种情况:一种是分生组织迅速单极性分裂形成根原基; 另一种是维管组织结节细胞出现分化, 其外围的组织进行平周分裂呈层状, 径向伸长, 形似维管形成层状的细胞; 内部的细胞停止分裂活动, 细胞壁不均匀加厚, 失去细胞内含物, 形成管胞。它的形状像一个鸟巢(图版Ⅱ-2), 因此有的报道中称它为鸟巢状维管组织团, 有的称为维管组织结节、管胞集团等(王凯基等, 1981; 许志宏等, 1980; 过全生, 1997)。它在组织培养中是一种常见的现象。在本实验中观察到的数量也较多。维管组织结节外围的层状分生细胞如果呈多向分裂分化, 则不形成根原基, 而在愈伤组织中扩展形成不规则的拳卷状维管组织系统(图版Ⅱ-3), 这在老化的愈伤组织中尤其多。维管组织结节常发生在愈伤组织内部, 有时在木栓化愈伤组织近表面处也有发生。愈伤组织内部分裂旺盛部位的细胞中, 常有淀粉类内含物出现, 随细胞的分裂和分化而逐渐被消耗掉。

芽的起源和发生过程:在离体培养20 d以后的白桦茎段愈伤组织中, 愈伤组织近表面局部区域的薄壁细胞核变大, 细胞质变浓, 分裂加快, 进而形成苗端分生组织, 在愈伤组织外围形成染色较深的小突起。苗端分生组织进一步分化出叶原基, 形成芽(图版Ⅱ-4)。进一步观察发现这些芽都远离木栓化表皮的一侧, 而愈伤组织周缘有木栓化的地方没有芽的形成。这说明木栓化细胞的形成抑制了不定芽的分化, 这与Lu等(1993)的结论相同。芽的形成是否与维管组织结节有关还有待进一步研究。从外部形态上看, 培养20 d, 愈伤组织外部有许多绿色的小突起。电镜扫描观察可见苗端突出愈伤组织表面, 小突起较光滑, 有的可见小的叶原基(图版Ⅱ-5)。有时不定芽能从茎段表面直接生成(图版Ⅱ-6)。

2.3 腋芽的增殖途径的不定芽形成

高等植物的叶腋中都有腋芽的存在, 由于顶芽的存在, 顶端优势阻止腋芽的生长。但除去顶芽可以解除顶端优势, 腋芽便不断地分化生长, 逐渐形成芽丛, 这是增殖的重要途径。白桦茎段(带2~3片叶)培养15 d后, 电镜扫描观察在主茎与侧枝的叶腋附近均可见有小的突起(图版Ⅱ-7), 进而形成腋芽。腋芽由几层鳞叶原基包裹, 叶原基上分布有表皮毛。腋芽有的在腋处, 有的在其上部, 1至多个不等, 基本上由靠近表层的薄壁细胞启动形成苗端(图版Ⅱ-8)。

2.4 不定根的形成过程及与愈伤组织的关系

不定根的形成过程:白桦不定根的形成, 最快为5~6 d, 通常10~15 d。培养3 d, 从外部形态观察可见在近切口端的表皮有明显的膨大。6 d时经电镜扫描, 在茎段的基部周缘有圆形的小突起。通过解剖观察可知, 在幼茎的内部有少数的维管射线细胞在与形成层的交叉处开始呈楔形变宽, 成为多列射线, 在向髓心的一侧仍为单列。因而, 在加宽的部位与紧靠韧皮部的地方形成一团细胞核较大、细胞质较浓的细胞团——根原基的发端细胞。这些细胞继续分裂、生长, 逐渐形成体积小、染色深的一群分生细胞, 形状近似球形, 这就是根原基(图版Ⅱ-9)。在朝向表皮一端的细胞团转变为不定根的顶端分生组织, 位于不定根后端的细胞从外向内逐渐分化形成根的维管系统, 最终与茎的维管系统相连。同时, 根原基出现明显的分层现象。位于最先端的是几层根冠细胞, 由许多不规则的薄壁细胞组成, 起保护的作用, 其下面是排列紧密的顶端分生组织, 并出现了较短的伸长区。

不定根的形成与愈伤组织形成的关系:从外部形态上看, 生根培养中的不定根形成部位多在切口上方0.2~2 cm的皮部, 其范围取决于不定枝插入培养基的深度。生根好的不定枝在基部切口处基本不产生愈伤组织或产生极少, 生根差的不定枝产生的愈伤组织多, 这种愈伤组织通常不形成不定根。由此可见, 生根培养中不定枝基部愈伤组织的发生和皮部生根间表现为相互抑制的关系, 这一点与白桦扦插生根情况相吻合(林艳等, 1996), 这也是不定枝生根性状差或材料老化的表现。

3 讨论

白桦不定根可以从枝的皮部产生, 也可由愈伤组织或叶脉直接形成。生根培养中, 不定根主要以皮部生根为主, 这种生根方式快且根系质量好, 呈辐射状排列, 移栽成活率高。不定枝基部切口一旦形成较大的愈伤组织, 则生根时间延长, 根数量少, 此种情况下不定根从基部表皮与切口愈伤组织交界处伸出。

Lu等(1993)研究了日本白桦茎段产生愈伤组织分化不定芽与AOA和AOPP的关系。结果表明切口处的愈伤组织起源于韧皮部, 而不定芽的分化产生于木栓化表皮不足的愈伤组织表面区域。在培养基中加入AOA、AOPP等苯丙氨酸解氨酶(PAL)的竞争抑制剂可以阻止木栓化表皮的形成, 加速茎段愈伤组织表面分化不定芽。由此可见, 不定芽的形成可能受愈伤组织表面木栓化表皮的抑制, 通过阻止木栓化表皮形成可以加速不定芽的形成。本实验中, 在对白桦离体培养的愈伤组织诱导阶段也发现, NAA能诱导愈伤组织的大量产生, 但较高浓度的NAA却加速愈伤组织的老化, 降低芽的分化率。解剖观察表明这是因为木栓化表皮产生过多造成的。

通过腋芽增殖途径, 白桦不定枝主茎和侧枝的叶腋处均可大量形成腋芽, 由此可达到大量繁殖优良材料的目的。但培养中茎基伤口也产生愈伤组织, 愈伤组织经过脱分化存在遗传变异, 因此由其分化的不定芽形成的苗木不能完全保证遗传品质与原材料的一致性, 组培繁殖中应尽可能将二者分开。在培养中发现, 枝基部愈伤组织上芽点出现的晚, 且常出现在远离主茎的愈伤组织的边缘。与其它培养基对比, 在腋芽增殖培养基中愈伤组织产生芽的数量少且晚, 较腋芽分化迟20 d左右。所以可通过时间差及时将2种再生系统的不定芽分开, 也可通过激素调节抑制愈伤组织中芽的形成, 加速腋芽的增殖。从而获得优良且无变异的白桦苗。