低温锻炼可提高植物的抗寒冻性已被许多实验所证实(沈征言等, 1983; 戴金平等, 1991; 潘杰等, 1994; 刘祖祺等, 1990; 刘鸿先等, 1991; Guy et al., 1987), 但其机理至今尚未清楚。自从1976年Weiser首先提出植物低温锻炼中基因表达发生改变, 从而合成新的蛋白质的观点以来, 植物低温诱导蛋白与抗寒冻性关系已成为研究热点。本文以毛白杨BT17无性系为试材, 旨在探讨低温锻炼及总可溶性蛋白质含量变化与抗冻性的关系, 为毛白杨抗冻改良与栽培提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 材料

取自北京林业大学毛白杨研究所苗圃。选取半年生、高约40~50 cm、生长健壮、长势一致的毛白杨BT17无性系扦插盆栽苗, 在2000年7~8月份进行试验。

1.2 材料处理

将供试毛白杨幼苗分3大部分。(1)第1部分幼苗再分19组, 每组10株, 其中1组置于25~30℃, 每天光照6 h条件下作为对照, 其余18组移入低温生化培养箱中, 并分别用-10℃、-9℃、-8℃、-7℃、-6℃、-5℃、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃、0℃、1℃、2℃、4℃、6℃、8℃、10℃和12℃处理7 d, 每天光照6 h, 观察幼苗发生冻害情况。(2)第2部分幼苗另分2组, 每组10株, 其中1组移入-1℃锻炼1~7 d, 并将其中锻炼5 d后的部分幼苗移入-2℃锻炼1~7 d; 另一组直接移入-2℃锻炼1~7 d; 最后, 将第1组经-2℃锻炼5 d后的部分幼苗再移入-3℃锻炼1~7 d。光照条件与(1)相同。每天分别取叶样测定。(3)将第3部分幼苗分2组, 每组10株, 其中1组用20 mg·L^-1蛋白质抑制剂环己亚胺(cycloheximide:CH)处理(见表 2), 每天光照6 h; 另一组进行光照对比实验(见表 3)。

1.3 幼苗存活率及抗冻性测定

参照潘杰等(1994)和Guy等(1987)的方法, 并略有修改。将(1)、(2)和(3)处理后的幼苗置于低温生化培养箱中, 以0.5℃·min^-1的速率降至-10℃, 停留12 h后转到25~30℃条件下, 2 d后测定幼苗的存活率, 幼苗是否正常生长以及叶片褐变程度是测定存活率的标准。以100%幼苗存活的最低温度的高低来表示抗冻性的大小。

1.4 总可溶性蛋白质的提取及其含量的测定

(1) 总可溶性蛋白质的提取  按谷瑞升等(1999)的方法。(2)总可溶性蛋白质含量测定  按Bradford (1976)的蛋白质-染料结合方法, 以BSA为标准蛋白, 并根据每g鲜重材料的蛋白质含量=μg· (100μL) ^-1×稀释倍数×总体积/g鲜重来计算。

2 结果 2.1 不同低温处理下毛白杨幼苗的受冻情况

试验结果表明, 生长在25~30℃条件下的毛白杨幼苗, 分别用12℃、10℃、8℃、6℃、4℃、2℃、1℃、0℃、-1℃、-2℃和-3℃处理7 d后, 幼苗叶片浓绿、生长茁壮; 在-4℃的低温下处理24 h便开始出现褐变、萎蔫等冻害现象, 冻害症状随温度降低与处理时间延长而加剧; 当在-5℃、-6℃、-7℃、-8℃、-9℃和-10℃下分别处理72 h、60 h、48 h、27 h、18 h和12 h后幼苗叶片全部死亡, 但生长在-1℃条件下7 d的幼苗在-4℃下5 d并不发生任何冻害现象, 生长在-2℃条件下7 d的幼苗在-4℃甚至在-5℃下5 d并不发生任何冻害现象。而生长在-1℃下10 d的幼苗在-4℃下3 d便开始出现冻害症状。由此可见, -3℃是未锻炼的毛白杨幼苗发生冻害的临界温度, -1℃即开始影响毛白杨幼苗的抗冻性。

2.2 不同低温锻炼对毛白杨幼苗存活率及抗冻性的效应

从表 1中可以看出, 未锻炼(对照)毛白杨幼苗-10℃处理12 h后的存活率和100%幼苗存活的最低温度分别为0和-3℃, 处理2和处理4的幼苗存活率分别为20%和30%, 抗冻性由对照的-3℃分别提高到-4℃和-5℃, 其后即使再延长锻炼时间, 幼苗的存活率和抗冻性还维持不变(如处理3和5);在处理6条件下, 幼苗的存活率也仅为45%, 抗冻性仅比对照提高3℃ (-3℃→-6℃); 而在处理7条件下, 幼苗的存活率和抗冻性已开始明显提高, 分别比对照提高了55%和4℃; 只有处理8条件才有利于幼苗抗冻性完全发育, 此时的存活率可达100%, 抗冻性可比对照提高9℃ (-3℃→-12℃), 但延长锻炼时间也不能再继续增强其抗冻性(处理9)。上述结果表明, 毛白杨幼苗先后经过-1℃、-2℃和-3℃ 3个阶段的低温锻炼后才有可能获得较高的抗冻性, 其中第3阶段(-3℃)低温锻炼对提高幼苗抗冻性的作用最明显。

为了寻找-3℃低温锻炼的合适天数, 对-3℃低温锻炼进程中的毛白杨幼苗的存活率和抗冻性作进一步分析(图 1和图 2)。结果发现, 在-3℃低温锻炼期间, 随着锻炼天数的延长, 毛白杨幼苗的存活率和抗冻性得到不断提高, 并于第5 d达最大值(100%和-10℃), 这表明幼苗抗冻性的提高是在低温锻炼过程中逐渐获得, -3℃低温锻炼的适宜天数为5 d。

2.3 不同低温锻炼对毛白杨幼苗叶片总可溶性蛋白质含量的效应

同未锻炼相比, 毛白杨幼苗在各种低温锻炼期间, 叶片总可溶性蛋白质含量均有所增加(表 1)。处理2和处理4的叶片总可溶性蛋白质含量虽比对照有所增加, 但增加程度相对较小, 其后即使再延长时间, 幼苗叶片的蛋白质含量几乎不变(如处理3和5);在处理6条件下, 幼苗叶片总可溶性蛋白质含量也仅比对照增加了21.4%;而在处理7条件下(即依次经过-1℃和-2℃各锻炼5 d后转入-3℃锻炼的第1 d), 幼苗叶片总可溶性蛋白质含量开始明显增加, 比对照增加了45.9%;只有处理8的条件才更有利于总可溶性蛋白质的积累, 其含量比对照增加了近60.3%。这说明先后经过-1℃、-2℃和-3℃3个阶段的低温锻炼对提高毛白杨幼苗蛋白质含量的效果最好, 其中第3阶段(-3℃)低温锻炼对蛋白质积累的效应最大。进一步分析发现, 在-3℃锻炼期间, 随着锻炼天数的增加, 幼苗叶片总可溶性蛋白质含量的增加呈现类似于幼苗存活率和抗冻性提高的变化趋势(图 1、图 2和图 3)。

2.4 -3℃锻炼期间环己亚胺(CH)处理对毛白杨抗冻性和叶片总可溶性蛋白质含量的影响

表 2数据表明, -3℃锻炼5 d后幼苗叶片总可溶性蛋白质含量可达617.5 μg· (gFW) ^-1, 抗冻性提高到-10℃。同-3℃锻炼5 d相比, 低温锻炼1 d, 然后经环己亚胺处理4 d者, 叶片总可溶性蛋白质含量由716.5 μg· (gFW) ^-1下降到480.1 μg· (gFW) ^-1, 抗冻性由-10℃下降到-4℃; 如果先将幼苗保持在-3℃下2 d再用环己亚胺处理3 d, 其叶片总可溶性蛋白质含量下降了98.3 μg· (gFW) ^-1, 抗冻性下降到-5℃, 而低温锻炼3 d后再用抑制剂处理2 d, 叶片总可溶性蛋白质含量仅下降68.7 μg· (gFW) ^-1, 抗冻性下降到-7℃; 如果低温锻炼4 d后才用抑制剂处理, 叶片总可溶性蛋白质含量[571.3 μg· (gFW) ^-1]及抗冻性(-8℃)降低的幅度均比前面的处理小; 低温锻炼结束后, 抑制剂处理并不影响总可溶性蛋白质含量及抗冻性; 最后, 如果在整个锻炼期间用抑制剂处理, 幼苗的叶片总可溶性蛋白质含量及抗冻性与-3℃锻炼前相同。上述结果表明, 随着抑制剂(CH)处理天数的增加, 叶片总可溶性蛋白质含量和幼苗抗冻性下降程度逐渐增大, 蛋白质抑制剂(CH)处理在一定程度上抑制了蛋白质合成, 减少了幼苗叶片总可溶性蛋白质含量, 从而降低了幼苗抗冻性, 反映出低温锻炼中幼苗抗冻性的发育和总可溶性蛋白质含量的变化有关。

2.5 -3℃锻炼期间光照条件对毛白杨总可溶性蛋白质含量和抗冻性的影响

试验结果发现, 同光下锻炼5 d相比, 光下锻炼4 d后转入暗中锻炼1 d, 叶片总可溶性蛋白质含量下降了53.6 μg· (gFW) ^-1, 而幼苗抗冻性几乎不变, 存活率达96.7%;如果暗中锻炼天数增加至2 d、3 d、4 d, 叶片总可溶性蛋白质含量分别下降了78.3、96.2和115.1 μg· (gFW) ^-1, 抗冻性由-10.0℃分别下降到-9.0℃、-8.3℃和-7.3℃, 幼苗存活率分别下降到90.0%、83.3%和70.0%;如果整个低温锻炼在暗中进行, 叶片总可溶性蛋白质含量和幼苗抗冻性下降程度最为显著, 总可溶性蛋白质含量下降了196.1 μg· (gFW) ^-1, 抗冻性由-10℃下降到-5℃, 幼苗存活率仅为53.3%。这说明低温锻炼过程中总可溶性蛋白质含量的增加和抗冻性的发育需要一定光照天数, 反映出暗中低温锻炼幼苗抗冻性下降与总可溶性蛋白质含量相应下降似乎有关。

3 讨论

植物抗寒性是植物长期适应低温环境而形成的一种潜在的遗传特性, 植物抗寒冻基因只是一种诱发性基因, 只有在特定条件(主要是低温和短日照)的作用下, 才能启动抗寒冻基因的表达从而发展为抗寒冻力(刘鸿先等, 1991; 简令成, 1987)。许多研究结果指出, 短日照处理能诱导植物的抗寒冻力(沈曼等, 1997), 越冬性植物必须在秋季低温和短日照条件下, 逐渐停止生长活性, 才能启动抗冻基因的表达, 进而发展植物的抗冻性(何若韫等, 1987)。Weiser (1970)认为越冬木本植物首先对秋季短日照起反应, 在短日照的作用下植物体内先合成一种抗冻基因的启动因子, 从而启动抗冻基因的表达并合成一系列有利于抗冻性提高的物质。沈征言等(1983)的试验表明番茄必须经过5~10℃和0~2℃的两步锻炼后才能使幼苗抗冷性得到完全发育。本试验发现, -1℃的低温即可开始影响毛白杨幼苗的抗冻性, 其中-3℃低温锻炼对幼苗抗冻性发育最有效; 但幼苗直接在-3℃下极易发生冻害, 因此必须先给以幼苗-1~-2℃的高于冻害发生的低温(-3℃)且分2个阶段进行, 使其在一定程度上增强对-3℃低温的适应性, 为第3阶段在-3℃低温锻炼的进行提供基础和可能性, 只有经过这样3个阶段的不同低温的锻炼后才有可能达到抗冻性完全发育的预期效果, 缺少其中任何一个阶段或减少锻炼天数都无法促进抗冻性完全发育; 而当幼苗抗冻性完全发育后, 再延长锻炼天数, 也不能再继续增强其抗冻性(表 1)。这说明毛白杨幼苗抗冻性的诱导及发育需要一定的程序、温度及锻炼时间, 不适宜的温度即使再延长锻炼天数也无法诱导抗冻性完全发育。抗冻性的发育是一个逐步获得的过程, 而且低温诱导抗冻性的提高也有一定限度(表 1, 图 1和图 2)。另外, 在-3℃锻炼期间, 随着短日照天数的延长, 幼苗存活率及抗冻性呈明显增加趋势(表 3), 这表明低温锻炼提高幼苗抗冻性不仅仅决定于锻炼的低温, 而且与植物发育所需的光照条件有关。

不少研究者已发现, 多种植物在低温锻炼期间, 细胞内可溶性蛋白和抗寒冻性之间表现出明显的正相关, 即可溶性蛋白含量随低温锻炼过程抗寒冻性的提高而增加(Guy et al., 1987; Mohapatra et al., 1987; Kazuoka et al., 1992; 刘祖祺等, 1990; 彭艳华等, 1992; 潘杰等, 1994; 李荣富等, 1996; 刘鸿先等, 1991; 陈杰忠等, 1999), 但也有研究指出, 可溶性蛋白质含量在低温锻炼中并没有实质性的改变, 或者可溶性蛋白质的增加与植物抗寒冻性的增强并不存在因果关系(Levill, 1980; 简令成, 1990; Uemura et al., 1996)。本试验的测定结果表明, 在不同低温锻炼期间, 幼苗总可溶性蛋白质含量和抗冻性都有不同程度增加, 其中在-3℃低温锻炼过程中总可溶性蛋白质含量的增加与幼苗抗冻性及存活率的提高相伴出现, 两者成明显的时间进程平行关系(图 1, 图 2和图 3); 用蛋白质合成抑制剂环己亚胺处理幼苗, 随着处理时间的延长, 蛋白质含量和抗冻性呈现相似的下降趋势(表 2), 环己亚胺是在翻译水平上抑制蛋白质合成, 看来低温诱导抗冻性可能是在翻译水平上受到调控; 另外, 逐渐缩短光照天数, 伴随着蛋白质含量减少的同时也降低了幼苗抗冻性, 反之亦然(表 3)。由此可见, 低温锻炼过程中毛白杨幼苗蛋白质含量的增加与抗冻性及存活率的提高密切相关, 蛋白质含量的增加, 有助于加强细胞的保水力, 提高细胞内的束缚水, 降低冰点, 并可能导致细胞液过冷的形成, 对发展高水平的抗冻性具有重要作用。由此, 有必要对低温锻炼中所增加的蛋白质的组份作进一步分析研究, 寻找出与抗冻性提高真正相关的行异性蛋白, 为毛白杨抗冻性改良提供基础。