人类最初对植物黄化类病害的认识是1902年发现的翠菊黄化病, 此后植物病理学家一直认为这种类型的病害是由病毒引起的, 因为它不能人工培养且能够通过细菌滤膜。1967年, 日本的土居养二在表现这类症状的植物筛管细胞中发现了一种在形态和大小类似于动物和人类菌原体的生物, 称之为类菌原体(Mycoplasma like Organisms, MLOs), 从1967年到1992年, 300多种植物的黄化和丛枝病害被鉴定为MLO, 直到1992年, 类菌原体才被正式俗名(trivial name)植原体(Phytoplasma)取代。近10 a来, 植原体的分子分类学进展很快, 对植原体病害的检测、流行和防治产生了深远影响, 并有望对这类当前最小的细胞生物的遗传学和系统学研究取得重大进展。

1 植原体的系统学位置

Tully和Bove等(1993)对柔膜菌进行了重新分类, 设立了虫原体(Entomoplasma)和中原体(Mesoplasma)两个新属, 将两属归于新成立的虫原体科(Entomoplasmatacae)中, 与螺原体科(Spiroplasma)共同组成虫原体目(Entomoplasmatales), 重新修正了菌原体目和科的描述。按照该系统, 柔膜菌纲包括四个目, 菌原体目(Mycoplasmatales)、虫原体目(Entomoplasmatales)、无胆甾原体目(Acholeplasmatales)和厌氧原体目(Anaeroplasmatales)。国际系统细菌学委员会(International Committee of Systematic Bacteriology, ICSB)柔膜菌分类分会(Subcommittee on the taxonomy of mollecutes) (1995)承认该分类系统并进一步修订了新种描述的标准, 列出了各属包含的种类(表 1)。暂定的植原体(Phytoplasma)属没有正式包括在本系统中, 但综合分析植原体16SrRNA序列、16S-23SRNA间隔区序列和rp序列等分子系统学研究结果, 已证实植原体是单系发育类群, 同无胆甾原体目成员Acholeplasma palmae和A.modicum等关系最近(Davis, 1997; Seemuller, 1998)。植原体作为柔膜菌的一员, 其系统学位置得到了公认。

2 植原体的分子分类学研究

20世纪80年代末期, 由于分子生物学技术, 特别是分子克隆和PCR技术的渗入大大加快了包括植原体在内的细菌系统学研究进展。Woese (1987)首次提出利用保守的16SrRNA基因序列分析来确定植原体系统学关系的建议, Weisberg (1989)首次用该方法确定了柔膜菌同其他有壁细菌的关系, 与此同时, Lim & Sears在1989年第一次克隆并测定了MLO基因组中16SrRNA基因的全序列, 系统分析了MLO与Acholeplasma的遗传关系, 后来他们又用分子克隆和PCR方法测定了两个核蛋白基因rp122和rp3的全序列, 进一步证明了MLO的DNA序列和氨基酸顺序与Acholeplasma laidlawii关系最近而与Mycoplasma关系较远。MLO的16SrRNA基因和核蛋白基因序列的发表是一项里程碑性的工作, 使得后来的许多作者能够用PCR方法扩增这两个基因进行分子系统学分析。如Deng (1991)和Ahrens (1992)等早期的对类菌原体的PCR扩增和初步分类, 尽管他们设计的引物特异性较差, 未能在以后的研究中普遍采用, 但是为后续研究奠定了基础。在1992年8月召开的国际系统细菌学委员会(ICSB)柔膜菌分类分会公报上, ICSB同意了Kirkpatric和Sears提出的方案, 即根据1992年以前的分子系统学研究, 该类具有较低的G+C含量(23%~29.5%)、很小的基因组(600~1 050Kb)、植物筛管细胞内寄生和16SrRNA基因序列相似性的生物既不是MLO, 也不是Mycoplasma, 而是一个独特的类群, 称为植原体(Phytoplasmas), 该俗名是科学有效而不违反任何细菌命名法规。同时作者界定了植原体的内涵, 即所谓植原体必须满足以下6个条件: (1)透射电镜下缺少细胞壁的多型原核生物; (2)应发现于植物筛管细胞内并与植物的衰退、叶片黄化或发育不正常的症状相关; (3)由植物筛管取食的叶蝉、飞虱或木虱传播; (4)抗青霉素并对四环素高度敏感; (5)基因组大小在600~1 200Kb间而且DNA的G+C含量低, 在23%~30%之间; (6) DNA系统分析应该在柔膜菌纲内。植原体的俗名一经提出即为全世界细菌和植物病理学家广泛采用, Toth和Sears (1994)用核蛋白基因序列有进一步确认了植原体与Acholeplasma palmae str. J233关系最近, 该菌株生活在椰子树根的边缘, 浸染造成椰子的黄化病害, 但并不侵入树木体内, 所以这是一个处于植原体与无胆甾原体过渡状态的菌株, 后来的一系列研究都将该菌作为分子系统学分析的外群。从而明确了植原体在柔膜菌纲中的系统学位置。

从1993年开始, 美国的Davis和德国的Seemuller两个实验室开始采用16SrRNA基因的RFLP和全序列来对植原体进行分子分类, 1993年几乎同时发表了植原体的16SrDNA的RFLP图谱(Lee, 1993; Schneider, 1993), 并用其进行了类群划分, 1994年又几乎同时发表了各类植原体的16SrRNA基因序列的分子分类结果(Gundersen, 1994; Seemuller, 1994), 至此植原体的分子分类学框架基本组成。日本的难波成任(1993)和秦国夫等也进行了本国的植原体的分子系统分类。到1994年召开ICSB会议时, 全球已经报道了14个16SrRNA群, 如何以分类学的观点处理这些遗传上差别很大的16SrRNA群就成为会议的焦点。最后会议决定使用暂定分类状态来建立植原体的分类学体系。

3 暂定学名的含义

90年代以来, 随着分子系统学研究的深入, 过去一些用纯培养的表型特征难以鉴定的原核微生物的系统学关系越来越清晰, 而且利用一些生物大分子的序列也能够对它们进行分类。但是对于一些至今尚不能人工培养的原核微生物来说, 仅仅用一个或几个DNA片段还无法将它们同过去几百年来用纯培养特征建立起来的分类系统合并, 也就是缺乏符合《国家细菌命名法规》 (International Code of Nomenclature of Bacteriology, ICNB)的可比较的表型特征。按照ICNB制定的准则, 细菌完整的基因组序列可以作为划分基本分类学单元的依据, 一个种的应该是包括具有70%DNA同源性的菌株。但由于目前人们还不可能分离到纯的植原体DNA进行同源性研究, 只能以部分基因的序列进行类群的鉴定。而细菌系统学家一直反对仅用少数DNA片段建立分类学单元的做法, 认为下述四种情况不应该描述为新的细菌属或种: (1)当信息仅来自一个样品的一段DNA序列; (2)通过序列特异性PCR引物的重新扩增, 遗传材料的真实性得到证实, 但是出现了一些含有无法证实的DNA序列; (3)在一个自然样品中, 能够检测到来自活细胞的遗传材料, 但是不能用原位杂交证明寄主中存在该细菌细胞; (4)通过原位杂交技术, 能够检测到样品活细胞中的遗传材料, 但是缺乏除系统学位置和形态学以外的有关特征。但是与此同时, 细菌系统学家又不能完全忽视DNA分子数据在细菌系统学研究中的重要性和贡献, 特别是对于象植原体、类细菌等很多原核生物来说, DNA是目前唯一有效的分类鉴定手段。针对这一情况, Murry和Schleifer (1994)提议用Candidatus (暂定状态)来容纳那些不能人工培养的, 以非常有限的数据(如基因组中很小一部分的核酸序列)确定的原核生物分类单元。Candidatus不是一个分类级别, 而是一个没有被《国际细菌命名法规》正式承认的分类状态。该建议同时提供了暂定分类单位的描述模式(表 2)。这一建议在1994年7月召开的国际系统细菌学会议上并得到一致同意。ICSB柔膜菌分会也在同一会议上提出使用暂定属名和种名(Candidative genus and species names)来处理植原体, 暂定属名即Phytoplasma。Murry和Stackebrand (1995)暂定状态的命名模式有做了补充, 需要记载的项目和略语如下:

如White等1998年报道的一个新的植原体暂定种的描述为:“Candidatus Phytoplasma australasia”[ (Mollicutes) NC; NA;O; NAS; (EMBLY 10097), oligonucleotide sequences of unique regions of the 16sRNA gene 5'-TAAA AGGCATCTTTTATC-3' and 5'-CAAGGAAGAAAAGCAAATGGCGAACCATTTGTTT-3';P (Carica papaya, Lycopersicon esculentum, phloem); M] (White et al., 1998)。用于暂定种鉴定的可以是各类DNA序列, 但是如果使用16SrRNA序列, 必须不得少于1 000对碱基。在植原体鉴定的形态特异型项目中, 要注明一段暂定种特异性的DNA序列作为探针。书写暂定种时必须加引号。一旦某一暂定种的培养特性得以清楚, 就可以按照细菌命名法规, 赋予相应的分类学名称; 如果暂定种的学名存在错误鉴定, 澄清后也要取消暂定学名。暂定种的出现, 解决了包括植原体在内的许多不能培养的微生物的分类学问题。如按照16SrRNA序列等, 柑桔黄龙病在亚洲和亚洲的两种病原菌被分别鉴定为“Candidatus Liberobacter asiaticum”和“Candidatus Liberobacter africanum” (Jagoueix, 1997)。

目前, ICSB认为, 在暂定种鉴定和可培养的柔膜菌分类鉴定中, 16SrRNA基因是首选的系统学标记, 但有时也不足以确定种, 用大量的一系列的保守基因序列进行系统学分析是非常必要的, 目前使用的有ITS区、核蛋白基因、Tuf基因、ftsZ基因、β-操作元序列, 热休克蛋白基因等, 选择合适的基因并评价其同16SrRNA基因序列的有用性是今后柔膜菌分子系统学的研究方向(ICSB柔膜菌分类分会公报, 2000), 这也是植原体暂定分类学的研究方向。

4 植原体暂定分类体系与问题

暂定分类学一经提出, 植原体分类学家在植原体的暂定属名中, 将已经鉴定的各16SrRNA类群赋予了暂定种名, 1996年植原体分类学工作组在李英敏和Seemuler划分的16SrRNA类群的基础上, 提出了12个暂定学名(表 3中具有学名的类群, 难波成任, 1996), ICSB柔膜菌分类分会同意将每一个16SrRNA类群作为一个暂定种(后续研究证明这可能并非合适, 后详), 但把他们提出的12个类群的暂定学名作为建议名而非正式暂定名, 只承认正式发表的酸橙丛枝病Candidatus P.aurantifolia的暂定学名(Zreik, 1995)。随着研究的深入, 李英敏进一步将已报道的植原体分为14个16SrRNA类群(暂定种) 38个亚组(Lee et al., 1998)。Seemuller (1998)用完整或接近完整的16SrRNA序列, 将57个植原体划分为20个16SrRNA类群(暂定种) (图 1), 并将另外189种植原体按其DNA限制性图谱或血清学数据, 归并到这20个16SrRNA类群中。在1996年12个类群的基础上, 又增加了8个类群。李英敏和Seemuller的分类系统有一些区别(表 3)。

此后, 一些植原体分类学家按照暂定种分别鉴定, 并正式发表了另外4个暂定种:Candidatus P.australiense (Davia, 1997), Candidatus P.australasia (White, 1998), Candidatus P.fraxini (Griffiths, 1999)和Candidatus P.japonicum (Sawayanagi, 1999)。在此过程中, 研究者发现在16SrRNA类群内的系统学变异很大, 类群内植原体在核蛋白基因和16S-23SRNA基因间隔区无论在RFLP还是序列方面都有差异, 能够分为很多亚组, 而且它们在生态学特性差别也较大。以上五个发表的暂定种中, 有4个是原来16SrRNA类群的亚组, Candidatus P.australasia和Candidatus P.aurantifolia是同属于花生丛枝16SrRNA类群(FBP或16SrⅡ)的两个亚组, 但是它们在系统学和DNA序列上都有差异, 应该作为暂定种处理; Candidatus P.australiense和Candidatus P.japonicum也同属于STOL16SrRNA类群(16SrⅫ)的两个亚组。只有Candidatus P.fraxini是白虹黄化16SrRNA类群。

因此, 目前植原体分子分类首要的问题是建立暂定种的标准, 究竟以多大的16SrRNA序列差异作为类群(暂定种)的划分阈值更为合适, 是以ICSB推荐的16SrRNA类群作为暂定种, 还是以16SrRNA类群内的亚组作为暂定种, 迄今还没有一致的标准。在种内的序列同源性标准上, EY、AY和AP16SrRNA类群内的序列差异分别在1.2%、1.6%和1.7%以下, 而WX和FBP16SrRNA类群内的序列差异为2.2%和2.7%以内; 在16SrRNA类群间划分标准上, 国际比较菌原体学研究组(International Research Programme of Comparative Mycoplasmology, IRPCM)植原体学工作组早期同意以2.5%的序列差异作为AY和STOL两个16SrRNA类群的划分阈值, Seemuller (1998)也以2.3%和2.4%分别作为AUSGY和IAWB的划分发阈值, 但这只是一个大体的分类群标准, 实际上有的16SrRNA类群, 如SCWL内不同菌株间的差异达到了2.3%和2.7%, 已超过了16SrRNA类群间的划分界限, 但仍然作为一个类群处理。由于划分16SrRNA类群的标准难以统一, 不同的作者得到的结果有一定出入, 如对于墨西哥长春花变叶(Mexican periwinkle virescence, MPV)植原体, Seemuller (1998)将其归到AY16SrRNA类群作为Ⅰ亚组, 而李英敏(Lee et al., 1998)则作为一个新的16SrRNA类群(ⅩⅢ)处理。对于枣疯病植原体, 植原体工作组1996年作为两个16SrRNA类群处理, 后来都放在EY类群中。

尽管16SrRNA基因序列比其RFLP图谱得到的结果更为精确, 但对于大量的植原体的分类鉴定, 目前难以逐一分析16SrRNA基因序列, 特别是许多实验室不一定都具备DNA测定条件, 而且对于一个未知的植原体也未必需要进行DNA测序。用PCR扩增16SrRNA基因序列, 并用一系列的内切酶产生的RFLP图谱, 进行分类鉴定, 被证明是一个简便、可靠而实用的手段, 其鉴定结果同DNA测序基本相同。目前研究者一般先应用RFLP进行类群和亚组的划分, 如确定属于新的类群, 再进行序列测定和系统学分析。李英敏(2000)发表了14个类群38个亚组的分类系统, Seemuller (1998)发表了一个20个类群的鉴定体系, 两个分类体系都综合了全世界研究发表的16RrRNA序列、各类基因区和非基因区的PCR-RFLP、DNA杂交和血清学等研究结果, 充分反映了植原体分类学的最新研究现状。限于篇幅, 此文仅介绍李英敏的分类表(表 4), 事实上Seemuller (1998)的鉴定表更为完整, 包含的种类也较多。

对于16SrRNA类群内的进一步划分, 用16SrRNA类群作为分类标准显得过于保守, 研究者也利用16S/23S间隔区序列、23RsRNA序列、核蛋白(rp)基因和tuf基因序列进行系统学研究。在这些DNA序列中, 23SrRNA序列比16SrRNA序列还要保守(Guo, 1998), Tuf基因序列比16SrRNA序列的变异程度要高, 如Schneider (1997)研究表明, 按照Tuf基因序列, STOL类群与AY类群的距离要比以16SrRNA序列建立的遗传距离还要远, 进一步证实, STOL不应该是AY的亚组。rp基因序列的变异性较大, 进化速率较快, 是进行亚组分类的有效手段, 李英敏使用rp基因的RFLP进行了亚组划分。16S/23S间隔区序列的进化速率介于16SrRNA序列和rp基因序列之间, 也是一个变异程度较高的区域, 是亚组区分和检测植原体的一个有效手段( Smart, 1997)。

第二个问题是植原体基因组中存在两种16SrRNA基因, 主要是两个基因操作元(Operon)的序列间存在差异, 就是两个菌株间的16SrRNA基因序列的差异可能是同一种植原体的操作元序列不同, 而不是真正的两个类群(liefting, 1996)。这种异质性在植原体中最早由Schneider (1994)发现, 后来发现它在其它柔膜菌和植原体中都普遍存在(Davis, 1998; Lauer, 2000), 而且在同一种中导致16SrRNA基因序列异质性的机制也不同, 可能是复制错配和水平基因转移(horizontal gene transfer)造成的(Ueda, 1999)。这可能导致依据DNA序列的植原体分子分类的错误, Marcone (2000)试验证明, 翠菊黄化暂定种中, 许多亚组间的rDNA的RFLP差异实际上是两个植原体rRNA操作元的序列异源性引起的, 这种序列异质性在该种的16SrI-D, -D, -E, -K, -L, -M亚组中都存在, 而且该种的-L和-M亚组同-B亚组间的差异实际上就是由于操作元序列差异造成的, 它们实际上是同一个类群, 并据此修订了该种的亚组划分。该种D亚组的泡桐丛枝病植原体以前一直认为存在A和B两个类型, 它们并不是混合侵染的两个株系, 实际上也是由于操作元序列差异产生的。这表明, 以前由于没有认识到这种操作元序列异源性的影响, 可能还有一些亚组水平的鉴定错误。但是这一问题对于植原体的大的分子分类框架不会造成大的影响。

第三个问题是当描述一个新植原体时, 还要特别注意植原体的混合侵染的问题, 同一寄主上可能存在差别很大的或是密切相关的植原体种类, 这时需要使用多个引物进行扩增, 如果可能, 要使用引物和特异性引物来进行检测, 否则也将导致错误的分类鉴定。

5 植原体分子分类的发展方向

关于植原体的系统学今后的研究方向。鉴于植原体在柔膜菌纲中是一个单系进化类群, 其生理特性和生态特点又十分特殊, 而且在分子系统发育关系上, 它同目前建立的柔膜菌其它几个目是并系发育类群(Lee et al., 2000)。所以笔者认为应该将其作为柔膜菌纲中的一个独立的目, 即植原体暂定目似乎更符合实际情况, 含有一科, 每一个16SrRNA类群至少应作为一个属来处理, 大的属应包括多个种(亚组), 如Candidatus P.australiense和Candidatus P.japonicum, 小的属目前可含单个种, 如Candidatus P.fraxini。主要理由是:

5.1 16SrRNA序列极为保守

在ICSB的分类规则中, 明确规定了一个细菌种应包括至少70%的DNA同源性的菌株, 而以70%~85%同源性作为划分亚种的标准, 对植原体还难以开展这项实验。但是根据目前其他细菌中的研究, 16SrDNA的序列实际上比上述规定的DNA同源性更为保守, 一些用DNA同源性和表型特征鉴定的细菌近似种, 经分析它们的16SrDNA序列相似性达到了99%或更高(Lee et al., 2000), 而目前我们用95%~99%作为16SrDNA16SrDNA类群亚组的划分标准, 用88%~94%作为16SrDNA类群的划分标准, 都远远低于已知细菌的种间的16SrDNA的序列相似性。这表明ICSB推荐的植原体暂定种的标准过于保守。

5.2 16SrRNA类群内实际上包含着很多异源性的亚组

且不论上述SCWL类群内的菌株间异源性高达2.7%, 就是同源性很高的AY类群中, Marcone et al. (2000)用rDNA序列和tuf基因序列发现也明显存在8个亚组, 它们作为一个种是完全可以接受的(图 2), Gundersen et al. (1996)也发现了同样的现象。事实上目前已经鉴定的4个暂定种就是16SrRNA类群的亚组。

这种将植原体作为柔膜菌单独分类群的观点实际上代表了相当一部分学者的看法, 李英敏等一些作者早就建议用16SrRNA类群作为暂定属的标准, 而用核蛋白等基因序列作为暂定种划分标准。但1998年召开的ICSB柔膜菌分类分会没有批准。这主要是因为目前应用的DNA片段较少, 分析的DNA序列还不足以代表整个植原体基因组的DNA同源性。近年来, 很多研究者正在进行植原体全因组的物理图谱建立, 期望通过近缘原体基因组间的比较, 获得更多的DNA序列或基因形状来进行分子分类, 并进而探讨它们的DNA同源性(Firrao, et al.1996; Lauer et al., 2000), 但是迄今研究表明, 植原体基因组是相当异质性的, 不同植原体的基因组大小相差很大(Padovan et al., 2000)。能否以此绕开纯培养的难题, 开展植原体的分类学研究, 还需要进一步探讨。今后一个时期, 种的概念界定、植原体分类级别等仍然是植原体研究的焦点问题之一。但我们相信, 随着研究的进一步深入和大量证据的积累, 植原体的分类问题最终将会得到解决, 并得到ICSB的承认。