我国“三北”生态环境建设区有大量盐碱地, 提高树木耐盐性, 培育耐盐品种是开发利用这些盐碱地的一条有效途径。盐生植物耐盐机理研究证明, 在高盐条件下, 盐生植物体内脯氨酸、甜菜碱、海藻糖、甘露醇、甘油等小分子相溶性溶质含量会大大增加, 这些相溶性溶质含量的增加可降低细胞渗透性, 阻止细胞水分外渗, 避免盐害产生(荆家海等, 1994)。通过基因工程手段, 给非盐生植物导入外来基因, 影响或改变植物生理代谢途径, 使植物体内产生和积累相溶性小分子物质, 可有效提高植物耐盐性(Kavi, 1995; Nakamara et al., 1994; Fillati, 1994)。醇类脱氢酶是一种双向酶, 存在于某些微生物及植物体内, 具有促进细胞中糖类物质向糖醇方向转化的功能。Tarczynski等(1992)、Mitchell (1993)、刘俊君等(1994;1995a; 1995b; 1996)发现将大肠杆菌中mtlD (1-磷酸甘露醇脱氢酶基因)和gutD (6-磷酸山梨醇脱氢酶基因)导入烟草后可使烟草中山梨醇含量提高, 并新产生合成和积累甘露醇的能力, 从而大大提高了烟草耐盐性; 同时发现mtlD/gutD双价基因作用效果好于单价基因。受此启发, 2001年, 选择“三北”地区广泛栽植的美洲黑杨×青杨作为改良对象, 系统开展了mtlD/gutD双价基因转化研究, 得到了38株卡那霉素抗性植株。抗性植株经PCR检测, 28株呈阳性。对其中5株PCR阳性植株进行Southern及Western杂交, 有4株二者均呈阳性, 证明mtlD/gutD双价基因成功整合到这4株杨树基因组中, 并翻译表达产生了相应的酶。耐盐实验证明这4株转基因植株耐盐性较对照均有不同程度提高。

1 材料与方法 1.1 基因、植物表达载体及农杆菌菌株

基因为mtlD/gutD双价基因。mtlD、gutD单价基因分别克隆自大肠杆菌K12菌株。植物双价双元表达载体为pBIGM, 由植物双元表达载体pBin438构建而成。农杆菌菌株选用LBA4404, pBIGM双价双元表达载体构建好后采用直接转化法转入LBA4404。pBIGM上含有双价基因mtlD/gutD、双重增强的35S启动子和TMV“Ω”片段的翻译增强子及NPT-Ⅱ卡那霉素抗性标记基因(刘俊君, 1996), 其结构见图 1。

1.2 植物材料

选用美洲黑杨×青杨试管实生苗作为转基因植物材料。

1.3 转化及筛选 1.3.1 菌的活化

转化前一天晚上, 用接种环取保存在YEP固体培养基上的含有mtlD/gutD双价基因的LBA4404菌落少许, 接种到YEP液体培养基中, 28℃, 150 r·min^-1, 过夜振荡培养12 h, 使农杆菌处于旺盛对数生长期。接种前, 取活化菌液1 mL, 以30倍MS液体培养基稀释备用。

1.3.2 叶片不定芽诱导培养基及卡那霉素耐受浓度

通过实验, 选出美洲黑杨×青杨叶片最佳不定芽诱导培养基为MS+6-BA 1 mg·L^-1+NAA0.05 mg·L^-1, 叶片不定芽诱导卡那霉素耐受浓度为50 mg·L^-1。

1.3.3 不定芽生根培养基及卡那霉素耐受浓度

通过预实验, 选出美洲黑杨×青杨不定芽生根培养基为1/2MS+NAA0.01 mg·L^-1, 不定芽生根卡那霉素耐受浓度为50 mg·L^-1。

1.3.4 转化、筛选

采取Horsch (1985)发明的叶盘法。操作步骤如下所述。取美洲黑杨×青杨杂种叶片若干片, 用手术刀在叶脉处横切划痕后放入LBA4404的30倍MS稀释液中, 浸泡2~3 min后取出, 放入不含任何抗生素的芽诱导培养基MS+6-BA 1 mg·L^-1+NAA0.05 mg·L^-1中。(25±2) ℃暗室中共培养3~5 d, 待叶片与培养基接触处出现肉眼可见菌落时, 一部分叶片马上转入含有500 mg·L^-1羧苄青霉素(用于杀死过量农杆菌)及50 mg·L^-1卡那霉素的芽诱导培养基中培养; 另一部分叶片待21 d左右, 叶片切口出现芽点后, 转入以上培养基中培养。每10 d换一次培养基。2个月后, 待转化芽长度达1 cm左右, 转入加有卡那霉素50 mg·L^-1的生根培养基MS+NAA0.01 mg·L^-1中继续培养。1个月后, 选择生长健壮的生根卡那霉素抗性植株作为初选转化植株, 将其扩繁后用于分子生物学检测及耐盐性测定。

1.4 卡那霉素抗性植株的分子生物学检测 1.4.1 PCR检测

(1) 美洲黑杨×青杨杂种DNA的提取    用Edwards等(1991)所述方法提取美洲黑杨×青杨DNA。(2)阳性对照质粒DNA提取    含有P^MTD (其中含mtlD基因)及P^GUD (其中含有gutD基因)阳性对照质粒的大肠杆菌DH5α由中科院微生物所提供, 其质粒DNA的提取采用Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System试剂盒提取。(3) PCR扩增及检测    引物由北京鼎国生物技术发展中心合成, 其序列见刘俊君等(1995b)。PCR反应体系中dNTPs、Taq酶、反应缓冲液均购自北京鼎国生物技术发展中心, 操作程序如下。取样品及美洲黑杨×青杨杂种阳性对照DNA各4 μL, 加入放有2.5 μL反应缓冲液、0.5 μL dNTPs、0.25 μL 3′引物和0.25 μL 5′引物的微量离心管中, 再加入17 μL双蒸水及0.5 μL Tag酶(2U·μL^-1), 使反应液总体积达25 μL。反应条件为每循环94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 共35个循环。反应前可预变性2 min, 反应结束后延伸加时5 min。反应结束后取反应混合液5 μL, 放在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳, 电泳电压为3~5 V·cm^-1。凝胶经EB染色后, 用自动成像系统检查PCR电泳结果, 并拍照。

1.4.2 Southern杂交(ECL法)

(1) 膜板质粒DNA制备    采用Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification system从大肠杆菌DH5α中提取含有mtlD或gutD基因的KS质粒。质粒的DNA的酶切用HindⅢ和EcoRⅠ。酶解DNA片段用0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离, 长波紫外光下切割含有目的片段的凝胶。目的片段的纯化采用北京鼎国生物技术发展中心生产的DNA快速纯化/回收试剂盒。(2)探针标记(ECL法)    用Amersham LIFE SCIENCE公司生产的direct nucleic acid labeling and detection systems标记探针。(3)样品DNA酶切及电泳    美洲黑杨×青杨样品DNA的酶切同质粒的DNA的酶切, 所用酶为HindⅢ和EcoRⅠ。电泳用0.8 %琼脂糖凝胶电泳。(4)转膜、杂交及洗膜、信号产生及检测    使用Amersham LIFE SCIENCE公司生产的direct nucleic acid labeling and detection systems开展转膜、杂交及检测。

1.4.3 Western杂交

(1) 阳性对照蛋白的提取    将含mtlD、gutD基因的重组阳性菌种DH5α接种于LB液体培养基中, 37℃过夜培养10~12 h。次日取1 mL菌液溶于100 mL LB中, 37℃继续培养2~3 h至OD₆₀₀=0.5。升温至42℃培养3~4 h, 将菌体分装于1.5 mL eppendorf管中, 离心收获菌体。菌体蛋白的提取采用常规大肠杆菌蛋白提取方法。(2)样品可溶性蛋白提取    采用常规植物可溶性蛋白方法提取美洲黑杨×青杨可溶性蛋白。(3)蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳    蛋白质采用Tris-甘氨酸体系的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。分离胶浓度为10%, 层积胶浓度为5%。(4)蛋白质的转膜    使用Bio-Rad半干电泳转移体系, 转膜电流250 mA。(5)免疫反应    mtlD、gutD的第一抗体(兔抗)由中国科学院微生物所提供, 磷酸脂酶标记的第二抗体购自Promeaga公司。其余操作同一般Western杂交。

1.5 转基因植株抗盐性测定

取PCR检测呈阳性的美洲黑杨×青杨杂种卡那霉素抗性植株及未转基因植株各10株, 放在加有5种不同NaCl浓度的生根培养基中培养。2个月后根据不同浓度下植株存活率, 判别其是否具有抗盐能力和抗盐能力大小。

2 结果与分析 2.1 转化及筛选

共设计了3个处理, 转化叶片261片, 结果见表 1。从表 1知, 对照叶片美洲黑杨×青杨杂种放在不含卡那霉素的不定芽诱导及生根培养基上, 叶片分化率及不定芽生根率分别达100%和92%, 平均每片叶产生生根不定芽9个, 说明美洲黑杨×青杨杂种叶片再生系统再生效率较高。接菌叶片在含卡那霉素的培养基上培养筛选, 叶片分化率及不定芽生根率分别为68.1%和19.6%, 平均每片叶仅产生生根抗性植株0.2个, 说明抗生素卡那霉素对转化美洲黑杨×青杨杂种选择作用效果非常显著, 抑制或杀死了大量非转化不定芽, 避免了大量非转化植株的产生, 减少了后继PCR检测工作量。从表 1还知, 卡那霉素加入时间对转化作用影响很大。共培养后, 若马上加入卡那霉素(转化1), 因转化细胞内NPT-Ⅱ基因表达量有限, 细胞很难在含有高浓度的卡那霉素培养基上存活并诱导成芽, 导致转化失败。共培养21 d (转化2)叶切口出现愈伤及芽点后, 加入卡那霉素, 虽增加了部分假转化植株出现频率, 但却获得了一定数量的卡那霉素抗性不定芽, 为后继进一步筛选提供了可能。

2.2 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测

用mtld基因(大小, 1 150b)引物, 对所得38株卡那霉素抗性植株均作了PCR检测, 其中28株呈阳性。6株卡那霉素抗性植株PCR结果见图 2, 其余32株卡那霉素抗性植株PCR检测图略。

从图 2知, R1、R2、R3 R4、R6均出现一条与阳性对照CK⁺ (mtlD基因, 大小约1 150b)大小一致的条带, 初步说明mtlD基因转入R1、R2、R3、R4、R6植株中。在双价基因构建中, gutD与mtlD基因连在一起, mtlD的转化成功, 说明gutD/mtlD双价基因转化成功。5条阳性带中, R3、R4、R6条带很亮, R1、R2条带较暗。其条带明暗不同可能是由于样品DNA提取浓度不同或PCR扩增时反应体系中各组分加样不匀造成。

由于植物基因组很复杂, 其上可能含有拟转化目的基因的同源序列或相近序列。同源序列或相近序列的存在可导致PCR扩增出现假阳性, 故PCR结果呈阳性并不能完全证明耐盐基因转化已获成功。为进一步证明耐盐基因已转化成功, 需继续作Southern或Western杂交测定。

2.3 Southern杂交

选取PCR阳性植株R1、R2、R3、R4、R6及阴性对照植株, 提取其DNA, EcoRⅠ与HindⅢ双酶切后, 用gutD基因(大小, 880b)标记探针开展Southern杂交, 结果见图 3。从图 3知, 阴性对照未出现任何条带, 阳性对照出现了一条很明显的杂交条带。R1、R2、R3、R4除在阳性对照同一位置出现很明显杂交带外, 还在带的前方出现了1条以上的杂交条带, 说明gutD基因成功整合到杨树R1、R2、R3、R4基因组中, 且拷贝数大于1。在双价基因构建中, gutD与mtlD基因连在一起, gutD基因的转化成功, 说明gutD/mtlD双价基因转化成功。R6未出现任何条带, 说明gutD基因未转化到该植株中, 其PCR阳性为假阳性。

2.4 Western杂交

提取Southern杂交阳性的R1、R2、R3、R4植株蛋白质和阳性菌种DH5α菌体(含gutD或mtlD重组阳性质粒)蛋白, 开展Western Blot。本实验选择含有重组mtlD阳性质粒的DH5α菌体蛋白作为阳性对照, 实验结果见图 4。从图 4知, Southern杂交阳性植株R1、R2、R3、R4及阴性对照均在与阳性对照(mtlD蛋白)相同位置出现一条条带。阴性对照杂交条带的出现, 说明美洲黑杨×青杨体内可能天然存在有mtlD (1-磷酸甘露醇脱氢酶)基因编码翻译的内源1-磷酸甘露醇脱氢酶。内源1-磷酸甘露醇脱氢酶的存在, 增加了Western分析的难度。在此情况下, 判别转化基因是否表达最精确的方法是通过测定转基因植株和未转基因植株体内所转基因表达产物多少来确定。当然, Western杂交实验中, 其杂交条带大小也能说明一定问题。杂交条带大, 颜色深, 基因表达产物多。本实验中, R4、R3、R2、R1植株(特别是R4、R3植株)杂交条带较阴性对照大, 颜色深, 说明这4株转基因植株所转mtlD基因进行了成功表达, 产生了比正常未转基因植株内源含量更多的1-磷酸甘露醇脱氢酶。

2.5 Southern杂交阳性植株耐盐性测定

取Southern杂交阳性植株R1、R2、R3、R4和未转化的阴性对照植株R0各10株, 开展转基因植株抗盐性实验, 结果见表 2。从表 2知, 对照R0抗NaCl最高浓度为0.2%。在0.2%NaCl浓度下, 2个月时存活率为70%, NaCl浓度高于0.2%, 存活率为0。4株PCR阳性植株中, R3、R4抗NaCl能力最强, 在0.6% NaCl浓度下, 2个月时存活率分别为70%和60%。R2抗NaCl能力中等, 在0.6%NaCl浓度下, 2个月时存活率为40%。R1抗NaCl能力较差, 在0.6% NaCl浓度下, 2个月时存活率为0;在0.4%NaCl浓度下, 2个月时存活率为50%。经分子生物学检测呈阳性的R1、R2、R3、R4 4株植株抗NaCl能力均高于对照的事实说明, mtlD/gutD双价耐盐基因不仅整合到杨树基因组中、翻译表达产生了相应的酶, 而且通过酶的作用, 将部分糖类物质转化成了糖醇类物质, 糖醇类物质含量的增加, 促进了杨树耐盐性的提高。转基因植株抗盐效果, 见图 5。

3 结论与讨论

通过叶盘法, 开展mtlD/gutD双价基因转化美洲黑杨×青杨的研究, 获得卡那霉素生根抗性植株38株。抗性植株经PCR检测, 有28株呈阳性。对其中5株PCR阳性植株进行Southern及Western杂交, 4株二者均呈阳性, 证明mtlD/gutD双价基因成功整合到杨树染色体组中并得到表达。耐盐实验表明这4株转基因植株抗NaCl能力比对照均有不同程度提高。

Southern杂交中, 4株转基因植株除在与阳性对照相同位置出现一条条带外, 还在该带的前方出现了几条短的条带。说明mtlD/gutD双价基因以多拷贝形式整合到美洲黑杨×青杨基因组中。尽管从理论上讲, 外源基因插入转基因植物基因组的拷贝数是随机的, 即可多可少, 但众多的转化实验表明, 基因转化多以单拷贝数插入, 且遗传稳定性好(王关林等, 1998)。本实验外源基因以多拷贝插入, 其遗传稳定性及遗传效应如何, 有待观察。

外源基因随机整合到植物基因组后, 由于插入位点不同, 会产生位置效应、共抑制效应、重排效应等遗传效应。本实验4株杨树转基因植株抗盐性均高于对照的事实说明, 所转基因进行了表达, 并未发生共抑制效应。4株转基因植株之间抗NaCl能力的差异可能由于位置效应(插入染色体位点不同)及插入拷贝数多少不一造成。

mtlD/gutD双价基因转入美洲黑杨×青杨后, 若体内存在与转基因烟草相同的甘露醇、山梨醇代谢途径(刘俊君等, 1995a), 则在mtlD/gutD作用下, 转基因杨树体内应该有甘露醇和山梨醇的产生。今后应完成转基因植株体内糖醇含量测定, 并研究糖醇含量与转基因植株抗盐性大小之间的数量关系。

本实验将mtlD/gutD双价基因转入美洲黑杨×青杨, 转化植株耐盐性比对照有一定程度提高, 但提高幅度有限。说明植物耐盐机理很复杂, 控制耐盐性状的基因很多。今后应加强植物耐盐机理研究, 克隆、构建更好的耐盐主效基因及微效复合基因, 提高转基因植株耐盐效果。