杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)为杜仲科单属植物, 不仅是名贵的滋补药材和保健品, 也是提取天然橡胶的工业原料, 还是一种重要的绿化和水土保持树种。

对于一个植物群体而言, 由于环境、遗传等因素的影响, 引起了个体次生代谢物含量上的差异性; 又由于次生代谢物合成、积累位点不同, 引起了同一个体不同部位上的差异性。不少人对此进行过研究(龚跃新等, 1999; 张宇等, 1997; 徐娟华等, 1998等), 但对杜仲不同部位次生代谢物含量的差异性研究不多, 仅见李家实等人(1986)的报导, 但分析的样品是市售的皮和叶, 不是在同一个体不同部位上的采样, 忽略了个体差异的影响。杜仲个体间差异极显著(张康健等, 1999), 且个体差异的显著性往往干扰不同部位差异的显著性, 使人们难以得出次生代谢物在不同部位分布的准确结论。至今, 有关排除个体差异性而分析杜仲不同部位次生代谢物含量的分布状况的研究未见报道。本文在排除个体差异因素的基础上, 研究杜仲各部位的次生代谢物含量变化, 目的是寻找出杜仲各部位次生代谢物含量的准确分布状况, 为合理利用资源、扩大应用部位提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 材料来源

在同一立地条件下, 选择已普遍开花结实的15龄优良单株。即平均胸径为15.1 cm、树高为6.5 m、生长健壮, 无病虫害的雌、雄株各3株, 挂牌标明。

1999-03开始观察, 对于同一株树, 在花期(4月份)采收雄花(雄株), 6月15日条带状剥皮(树干皮的1/30), 同时采叶(树冠中部), 10月份成熟后采收种子(雌株)。每次采样后, 在60~80℃条件下杀青, 取出阴干后分别植株和部位装袋封存备用。将所采种子脱壳, 用石油醚提尽油脂后, 在烘箱内于60℃下烘至恒重, 密闭保存备用。

1.2 主要仪器和试剂

754型紫外可见分光光度计上海第三分析仪器厂; 紫外分析仪上海科艺光学仪器厂; H6605T型超声波清洗器无锡超声电子设备厂; 桃叶珊瑚甙(光谱纯)和光纯药工业株式会社(日本); 绿原酸(光谱纯)德国; 芦丁上海试剂二厂。

1.3 研究方法 1.3.1 桃叶珊瑚甙的提取测定

采用改进对二甲氨基苯甲醛法对桃叶珊瑚甙的含量进行测定(董娟娥等, 2001) (Y=0.116 05A+0.000 33, R=0.998 7)

1.3.2 总黄酮的提取测定

采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法(冯煦等, 1992) (Y=-0.002 0+1.223 0A, R=0.999 7)

1.3.3 绿原酸的提取测定

采用反相高效液相色谱(HPLC)法(黄西峰, 1988; Takahashi et al., 1988)。色谱条件:色谱柱Nova-pak C₁₈ (4 μm, 3.9 mm×75 mm)。流动相甲醇-水-冰乙酸(10:90:1), 流速1m·min^-1, 检测波长232nm。

1.3.4 杜仲胶的提取测定

采用改进的碱浸法(马柏林等, 1994)。

2 结果与分析 2.1 不同个体、不同部位次生代谢物含量分析

由表 1可见, 无论是雌、雄个体之间, 或不同部位之间, 其次生代谢物的含量均有一定差异, 有的甚至达显著或极显著水平。由于我们所选个体排除了立地条件和采收时间的干扰, 所以, 这一结果又一次证明了个体生长发育特性(遗传基因)是调控次生代谢物含量的重要因素(张康健等, 1999; 2001)。

2.2 不同性别、不同部位次生代谢物含量比较 2.2.1 雌株不同部位次生代谢物含量分析

表 2表明, 不同部位次生代谢物含量存在极显著差异:果实中的桃叶珊瑚甙含量高达7.90%, 约为皮部的8.4倍(皮部为0.90%)、为叶部的6.4倍(叶部为1.23%); 叶部的绿原酸含量为1.72%, 约为皮部的4.9倍(皮部为0.35%)、为果实的8.6倍(果实中仅为0.20%); 叶部总黄酮的含量为1.74%, 约为皮部的6.5倍(皮部为0.27%)、为果实的5.8倍(果实为0.30%); 果皮杜仲胶含量高达8.25%, 约为皮部(皮部为1.60%)的5倍、叶部(叶部为1.44%)的5.7倍。除杜仲胶外, 皮、叶、果各部位中三种主要次生代谢物(绿原酸、桃叶珊瑚甙、总黄酮)之和也存在极显著差异, 果实为最高(8.41%), 叶部次之(4.68%), 皮部最低(1.55%)。由表 2还可以看出, 就某一种次生代谢物而言, 各部位含量高低的顺序为:杜仲胶:果 > 皮 > 叶; 桃叶珊瑚甙:果 > 叶 > 皮; 总黄酮:叶 > 果 > 皮; 绿原酸:叶 > 皮 > 果, 即桃叶珊瑚甙和杜仲胶在果实中含量高, 绿原酸和总黄酮在叶部含量高。

上述结果表明, 杜仲果实和树叶是次生代谢物含量较高的部位。

2.2.2 雄株不同部位次生代谢物含量分析

由表 3可知, 桃叶珊瑚甙在雄株各器官的含量差异不显著, 绿原酸、总黄酮和杜仲胶含量差异极显著。绿原酸在叶中含量最高(1.77%), 为皮的(0.46%) 3.8倍; 总黄酮在花中的含量最高(1.82%), 为皮的4倍(皮中仅含0.46%); 杜仲胶在皮中的含量多于叶部, 雄花中含量微。就某一种次生代谢物而言, 各部位含量高低的顺序为:桃叶珊瑚甙:叶 > 皮 > 雄花; 绿原酸:叶 > 雄花 > 皮; 总黄酮:雄花 > 叶 > 皮。

表 3中也显示, 雄株叶部和雄花的三种次生代谢物(绿原酸、桃叶珊瑚甙、总黄酮)含量之和, 均高于皮部。

2.3 杜仲次生代谢物部位分布差异性分析

由表 4可以看出, 杜仲各次生代谢物在不同部位中的含量差异极显著, 不仅某一个部位的各次生代谢物含量差异显著, 而且, 某一次生代谢物在不同部位的分布也呈现显著差异。由于我们所采样品来自同一株树上的不同部位, 故排除了个体差异的干扰。分析结果显示, 皮部杜仲胶的含量(1.83%)较高, 总黄酮的含量(0.36%)最低, 绿原酸的含量(0.41%)也较低; 叶部各次生代谢物含量以绿原酸(1.77%)和总黄酮(1.61%)为高; 雄花中总黄酮含量(1.8%)最高; 果实中桃叶珊瑚甙(7. 90%)和杜仲胶含量(8.25%)最高, 而绿原酸(0.20%)和总黄酮(0.30%)的含量很低。就不同部位中各次生代谢物含量而言, 桃叶珊瑚甙在果实中含量(7.90%)最高, 绿原酸在叶中的含量(1.77%)最高, 总黄酮在雄花中含量(1.82%)最高, 杜仲胶在果实中的含量(8.25%)最高。

综上所述, 就某一种次生代谢物而言, 不同部位的含量高低顺序为:绿原酸:叶 > 雄花 > 皮 > 果; 桃叶珊瑚甙:果 > 叶 > 皮 > 雄花; 总黄酮:雄花 > 叶 > 皮 > 果; 杜仲胶:果 > 皮 > 叶 > 雄花。就某一部位而言, 各种次生代谢物含量的高低顺序为:叶:绿原酸 > 总黄酮 > 杜仲胶 > 桃叶珊瑚甙; 皮:杜仲胶 > 桃叶珊瑚甙 > 绿原酸 > 总黄酮; 雄花:总黄酮 > 桃叶珊瑚甙 > 绿原酸; 果:杜仲胶 > 桃叶珊瑚甙 > 总黄酮 > 绿原酸。各部位的三种次生代谢物(绿原酸、桃叶珊瑚甙、总黄酮)含量之和, 果实最高(8.41%), 其次为叶部(4.76%)和雄花(4.06%), 皮部最低(1.91%)。

3 讨论

本次试验结果显示, 所测定的绿原酸、桃叶珊瑚甙、总黄酮等天然活性物质的含量, 均是叶部比皮部高, 这与李家实(1986)的研究结果不完全相同。多项研究资料(张康健等, 1999; 2001)和本文研究结果均显示, 杜仲次生代谢物含量的个体差异显著。而李家实(1986)所分析的样品是市售的皮和叶(不同个体混杂在一起), 不是来自同一个体, 也未在同一时期采收, 研究结果受到了个体差异(包括遗传因素和年龄因素的差异)以及采收时间差异的干扰。所以在研究其部位分布差异性时, 必须排除个体差异等因素的影响, 以保证结论的正确性。

杜仲的传统药用部位是采用茎干树皮入药, 这是因为古代人以为杜仲的药效是杜仲胶丝的作用, 认为杜仲胶丝是杜仲药材的特征之一, 且以胶丝多者为佳(秦振东, 1983; 冯风等, 1996)。而杜仲皮含胶量比杜仲叶高, 故认为杜仲皮入药的药效高。现代化学和医药学研究证明, 真正起药效作用的不是非水溶性的杜仲胶, 而是溶于水的生物活性物质。况且, 许多学者的研究资料证明, 杜仲叶具有与皮相同的药用有效成分, 其药用功能一致(秦振东, 1983; 徐诗伦等, 1983; 1985;朱丽青等, 1986; 张康健等, 1997)。杜仲叶资源丰富, 容易再生, 以叶代皮完全可行, 既能扩大药用部位, 又能合理利用资源。本次试验研究发现, 所测定的绿原酸、桃叶珊瑚甙、总黄酮等天然活性物质含量, 均是叶部高于皮部。这一研究结果, 为杜仲“以叶代皮”提供了新的科学依据。

杜仲果皮中含有丰富的杜仲胶(8.25%), 果仁中的桃叶珊瑚甙含量最高(7.90%), 此外, 果仁中的α-亚麻酸含量高达51% (果仁出油率为27.65%) (梁淑芳等, 1997), 因此, 果皮用来提取杜仲胶, 果仁用来提取杜仲亚麻酸油后再提取桃叶珊瑚甙, 一物多用, 是一个亟待开发的新资源。杜仲雄花中含有黄酮(1.82%)、绿原酸和桃叶珊瑚甙, 且黄酮含量还高于皮和叶, 是资源开发利用中的又一个新的部位。