杂种马褂木是以鹅掌楸属(Liriodendron)现存两个种中国马褂木(L.chinense (Hemsl.) Sarg.)和北美鹅掌楸(L. tulipifera L.)为亲本所创造的种间杂种，由叶培忠教授于1963年首次育成。30多年的栽培试验表明，该杂种不仅在生长和适应性性状上表现出强大的杂种优势，而且具有树型美观、枝叶浓密、生长期长、花色鲜艳等特点，从而显示出十分广阔的开发利用前景(王章荣，1997)。随着人们对杂种马褂木利用价值的不断认识，其推广应用规模迅速扩大，实践上急需一种方便、可靠的杂种识别方法。杂种马褂木及其回交代和F₂代均表现出明显的杂种优势，而且家系间在性状表现上变异很大，(李周歧等，2001)，从而说明了研究亲本选配的必要性。虽然，在形态(刘洪谔等，1991)、解剖(叶金山等，1997)和同工酶酶谱(黄敏仁等，1979)等方面杂种马褂木有别于双亲，可用于杂种识别，但形态标记受环境因素影响较大、同工酶标记也受基因表达的限制而影响其使用。传统的通过配合力分析选择亲本费力费时。基于检测DNA水平多态性的分子标记技术的发展为杂种识别和亲本选配提供了有效的途径，其中RAPD分子标记技术自从1990年(Williams et al.，1990)产生以来，因其操作快速简便广泛应用于生命科学的许多领域(卢江，1993)。本文采用RAPD分子标记技术，研究了中国马褂木、北美鹅掌楸和杂种马褂木的遗传差异，对杂种识别方法进行了探讨，并分析了亲本遗传距离与子代性状表现的相关性，以期为亲本选配和杂种优势预测提供依据。

选取中国马褂木5株(C1、C2、C3、C4、C5)、北美鹅掌楸5株(T1、T2、T3、T4、T5)和杂种马褂木6株(H1、H2、H3、H4、H5、H6)作为试验样株，样株年龄均在10 a以上，其中杂种马褂木为叶培忠教授于1963年人工杂交所得，两个亲本种种源不详，除T1生长于南京明孝陵外、其它样株均生长于南京林业大学校园内。1999-11从各样株上采集休眠芽2枚，参考Doyle和Doyle的方法(Doyle et al.，1990)提取总DNA。提取液中加入5%的PVP (聚乙烯吡咯烷酮)和2%的β-巯基乙醇。提取的DNA用含EB (溴化乙锭)的琼脂糖凝胶电泳检测浓度。随机选取Operon公司的280个随机引物，用6个样株的DNA样品进行PCR扩增，经过初筛和复筛，筛选出25个能产生多态性、清晰和明亮谱带的引物(表 1)用于正式扩增。PAPD扩增在PE9600上进行。反应采用20 μL体系；10倍反应缓冲液2 μL (100 mmol Ph 8.3 Tris-HCl，500 mmol KCl，20 mmol MgCl₂，0.01%明胶，5 g·L^-1 BSA)，Taq聚合酶1单位，dATP、dTTP、dCTP和dGTP各250 μmol，引物5 pmol，DNA模板50 ng左右。扩增程序为94℃预变性2 min；随后94℃30 s，40℃30 s，72℃1.5 min，38个循环；72℃延伸7 min后转入4℃保存。扩增产物用含有溴化乙锭的1.0%琼脂糖凝胶在1×TBE缓冲液中电泳分离，最后在紫外灯下用MP4+Polaroid摄像系统照像纪录结果。

表 1 RAPD随机引物及扩增谱带数 Tab.1 Primers used in amplification and the number of bands amplified

表 1 RAPD随机引物及扩增谱带数 Tab.1 Primers used in amplification and the number of bands amplified

以C1、C2、C3、T1、T2、T3、H1、H2、H3、H6作为杂交亲本，1998年花期按全双列交配设计进行控制授粉，聚合果成熟后采收，1999-03花盆播种，6月移栽。由于以北美鹅掌楸为亲本的全部杂交组合、以H3为母本的全部杂交组合及部分其它杂交组合(C1×C1、C1×H3、H1×H1、H1×H2、H1×H3、H2×H1、H2×H2、H2×H3、H6×C1、H6×C2、H6×C3、H6×H6)亲和力低、出苗数较少而未参加田间试验。共有30个家系参加了田间生长性状测定，6株小区，3次重复，完全随机区组设计，株行距30 cm×40 cm。1999-12调查苗高(H)和地径(ground line diameter，GLD)生长量。试验地位于南京林业大学育种试验圃。

RAPD谱带用“0”代表“无”、“1”代表“有”进行统计。每条谱带名称包括引物名、谱带分子量和强度(强度分3级，1为最强)。采用POPUGENE软件以(Nei，1978)的方法计算样株(亲本)间的遗传距离、再以非加权两两对比法(Unweighted pair group methods of arithmetic (average)，UPGMA) (Sokal et al.，1958)建立聚类图。以亲本遗传距离为自变量、生长性状家系平均值(对正反交家系取其平均值)为因变量，按常规直线回归和曲线回归方法进行相关分析(不包括自交家系)。

25个引物共扩增出136条谱带，其中80条谱带在16个样株间呈多态性，占58.82%。表 1列出了不同引物扩增的总谱带数(N₁)、在16个样株间呈多态性的谱带数(N₂)、在所分析7株亲本(C1、C2、C3、H₁、H₂、H₃、H₆)间呈多态性的谱带数(N₃)、在两个亲本种间呈多态性而两个亲本种内均呈单态性的谱带数(N₄)及在两个亲本种间呈多态性而两个亲本种及杂种内均呈单态性的谱带数(N₅)。可以看出，有19条谱带在中国马褂木和北美鹅掌楸间呈多态性而在种内呈单态性，说明可用于种的识别，其中11条谱带在杂种马褂木中呈单态性，可用于杂种识别。在这11个谱带位点中，OPK15-1 150/1、OPO12-550/3和OPAU16-1 200/3共3条谱带为供试5株中国马褂木所特有，可作为中国马褂木特征谱带。OPK09-600/1、OPO05-2 500/2、OPP03-950/1、OPP05-500/2、OPY20-450/1、OPAG12-1 400/1、OPAU05-600/1、OPAU19-1 400/1共8条谱带为供试5株北美鹅掌楸所特有，可作为北美鹅掌楸特征谱带。任何2条分别为两个亲本种所特有的谱带在6株杂种马褂木中均同时出现，可作为杂种特征谱带用于杂种识别。图 1是用引物OPP03对16个样株的扩增结果，显示杂种识别谱带OPP03-950/1。

图 1 引物OPP03对16个样株的扩增结果(箭头示杂种识别谱带OPP03-950/1) Fig. 1 RAPD fragments of 16 sample trees amplified with primer OPP03 M: Indicate molecular marker, C1~H6; Sample trees, the arrows show the band OPP03-950/1 which can be used in identification.

表 2是16个样株间的遗传距离，中国马褂木(C)、北美鹅掌楸(T)和杂种马褂木(H) 3个类群内个体间遗传距离的平均值及其变幅依次为0.120 8 (0.060 6~0.176 5)、0.158 5 (0.060 6~0.221 3)和0.175 5 (0.084 3~0.258 7)，3个类群间个体间遗传距离的平均值及其变幅分别为C-T:0.481 3 (0.390 9~0.543 2)、C-H:0.298 0 (0.203 1~0.369 4)和T-H:0.279 1 (0.194 2~0.348 3)。从类群内个体是遗传距离的平均值看，杂种马褂木大于两个亲本种，说明杂种一代分离较大，从而也说明对其作进一步选择的必要性和潜力。从各类群内和类群是个体间遗传距离的变化范围来看，与中国马褂木有关的3组遗传距离(中国马褂木类群内、C-T和C-H)的变幅不相互重叠，因此可用于杂种识别。如果某个体与一株已知中国马褂木的遗传距离小于0.18，则该个体也是中国马褂木；当遗传距离在0.21~0.37之间，则该个体为杂种马褂木；遗传距离大于0.40，为北美鹅掌楸。从样株间遗传关系聚类图(图 2)可以看出，在0.22的遗传距离上，可把16个样株分为3类，第1类包括全部5株中国马褂木，第2类包括全部5株北美鹅掌楸，第3类包括全部6株杂种马褂木。因此，利用RAPD遗传距离进行聚类分析，可有效地对中国马褂木、北美鹅掌楸和杂种马褂木进行识别。

表 2 样株间的遗传距离 Tab.2 Genetic distances among 16 sample trees tested

表 2 样株间的遗传距离 Tab.2 Genetic distances among 16 sample trees tested

图 2 样株间遗传关系聚类图 Fig. 2 UPGMA dendrogram based on genetic distances among 16 sample trees

表 3列出了17个杂交家系18株(仅有正交或反交的家系)或36株(正反交家系合并) 1 a生苗高和地径的平均生长量。可以看出，在苗高生长量上家系间差异较大，苗高生长量最大的家系(H1-H6，64.805 6)是最小家系(C2-C3，25.741 5)的2.52倍。在地径生长量上家系间也存在一定差异，但变异程度远小于苗高性状，地径最大的家系(H6-C1，1.250 0)是最小家系(C1-C2，0.949 8)的1.32倍。家系间在苗高和地径生长量上存在较大差异，说明家系选择的潜力较大，同时也说明研究亲本选配和进行杂种优势预测的必要性。

表 3 杂交子代家系1 a生苗高和地径平均生长量及亲本遗传距离^① Tab.3 Height and basal diameter mean increment of yearlingtrees of hybrid families and genetic distances among 7 parent trees

表 3 杂交子代家系1 a生苗高和地径平均生长量及亲本遗传距离① Tab.3 Height and basal diameter mean increment of yearlingtrees of hybrid families and genetic distances among 7 parent trees

在所用25个引物中，OPM07和OPAW07扩增出的7条谱带在所分析的7个杂交亲本间均无多态性，因而未纳入亲本遗传距离计算。其余23个引物共扩增出129条谱带，有60条谱带在所分析的7个杂交亲本间呈多态性(表 1)，占46.51%。7个亲本间遗传距离(表 3，与表 2略有差别)的最小值为0.089 1 (H1与H3)、最大值为0.382 5 (C1与H3)，最大值是最小值的4.29倍，说明亲本间遗传距离的变化范围较大，这对于分析遗传距离与子代性状表现的关系是有利的。以亲本遗传距离为自变量，分别与子代1 a生苗高和地径的家系平均生长量进行相关分析，结果表明亲本遗传距离与子代苗高和地径均表现为二次曲线相关，回归方程为：

复相关系数r分别为0.823 5 (H，P < 0.01)和0.509 0 (GLD，P < 0.05)。说明在一定范围内，随着亲本间遗传距离的增大其子代苗高和地径生长量提高(杂种优势提高)，当亲本间遗传距离过大时其子代的生长量又会降低(杂种优势降低)。两条回归曲线的极值点分别为D² (遗传距离) =0.229 9 (H)和D²=0.226 6 (GLD)，说明当亲本间的遗传距离在0.23左右时能获得最大程度的杂种优势，可以此作为杂交亲本选配的依据。

从群体遗传和进化的角度看，物种间的差异实际上是基因频率的差异。由于地理隔离的原因，中国马褂木和北美鹅掌楸在长期遗传、变异和自然选择过程中其基因频率必然发生变化，在某些基因位点上甚至可能发生基因的消失(基因频率为0)或固定(基因频率为1)，这些发生基因消失或固定的位点可作为特征位点用于种的识别。在本试验扩增出的136条谱带中，有3条谱带(OPK15-1 150/1、OPO12-550/3、OPAU16-1 200/3)在5株中国马褂木中均出现，而在5株北美鹅掌楸中均不出现，有8条谱带(OPK09-600/1、OPO05-2 500/2、OPP03-950/1、OPP05-500/2、OPY20-450/1、OPAG12-1 400/1、OPAU05-600/1、OPAU19-1 400/1)在5株北美鹅掌楸中均出现而在5株中国马褂木中均不出现，在6株杂种马褂木中这11条谱带均出现，因此，可作为特征位点。这11个谱带位点单独使用可进行种的识别，2条分别为两个亲本种所特有谱带的联合使用可进行杂种识别。从各类群内和类群间个体间遗传距离的变化范围来看，中国马褂木类群内为0.060 6~0.176 3、中国马褂木与北美鹅掌楸类群间为0.390 9~0.543 2、中国马褂木与杂种马褂木类群间为0.203 1~0.369 4，其变化范围不相互重叠，通过比较待测个体与一株已知中国马褂木的遗传距离，也可对其归属问题做出判断。聚类分析对16个样株无一例外的进行了正确归类，说明可以通过聚类分析进行种和杂种的识别。但是，由于本试验所用样本数较少，不能准确反映两个树种RAPD标记的特征。根据这11个谱带的基因频率，推断一个种中为1，另一个种为0，并用于单位点(或双位点)种(或杂种)识别尚存在一定风险。因此有必要加大试验样本，对上述位点作进一步检测。在目前情况下，在多位点检测的基础上通过计算遗传距离及在此基础上的聚类分析进行种和杂种的识别，可靠性较高。

正确的亲本选配是杂交育种工作取得成就的先决条件，获得杂种优势是杂交育种的主要目的之一。根据杂种优势遗传解释的显性学说和超显性学说，获得杂种优势的双亲要存在遗传差异，因此，遗传差异是选择亲本时必须考虑的一个重要因素(张爱民，1994)。遗传距离作为衡量双亲遗传差异大小的一个参数，必然和杂种优势有一定联系，因而常被用于亲本选配和杂种优势预测(龙漫远，1987；郭平仲，1989；王学得，1990；程备久，1992；Ramanujam et al.，1974；Arunachalam et al.，1981；Lee et al.，1989；Smith et al.，1990；Zhang et al.，1994；1995；Xiao et al.，1996；Chowdari et al.，1997；Baril et al.，1997)。在这一方面最早的报道是1963年Paterniani和Lonquist对玉米的研究，并发现二者之间存在线性正相关(Paterniani et al.，1963)。虽然在早期研究中亲本遗传差异的度量多基于形态标记或生化标记，而近年多基于分子标记，但从总的研究结果看二者之间存在相关性，包括直线相关和曲线相关，当然也有例外情况，这与所研究的性状有关(Chowdari et al.，1997)。从本研究的结果来看，鹅掌楸基于RAPD标记的亲本遗传距离与子代1 a生苗高和地径生长量均表现为二次曲线相关，复相关系数r分别为0.823 5 (H)和0.509 0 (GLD)，达极显著(H，P < 0.01)和显著(GLD，P < 0.05)水平，说明利用亲本遗传距离进行鹅掌楸亲本选配和杂种优势预测具有一定潜力。由于本试验分析家系数及家系内株数较少，未进行多点栽培试验、生长量仅为1 a生资料，及试验地并非为中国马褂木的适生区等，本研究仅是一种尝试和探索，所得结果供参考。