银杏(Ginkgo biloba L.), 又名白果, 公孙树, 著名的孑遗植物, 是珍贵的药用、材用、观赏用树种。但银杏的童期很长, 实生树开花需要20 a以上。为缩短银杏童期, 果树工作者从栽培方式、传统育种进行了大量的研究, 但成效不大。近年来应用分子生物学研究植物上的开花取得了很大进展。1992年, Weigel等从拟南芥菜中克隆到LEAFY基因, 指出LEAFY是一个花分生组织特征基因, 并调控植物开花的时间(Weigel et al., 1992)。Pena等将拟南芥菜LFY基因转入柑桔, 得到的转基因柑桔, 当年开花, 且果实正常, 其种子当年播种, 翌年春天即开花结果(Pena et al., 2001)。说明LEAFY基因的大量表达可促进植物提早开花, 这也在拟南芥菜、欧洲山杨(Weigel et al., 1995)、水稻(He et al., 2000)得到了证明。银杏雌雄异株, 其雌雄株在染色体核型、过氧化物同工酶谱等都有较大差异(梁立兴, 1988)。但银杏雌雄株LEAFY基因是否存在差异, 以及雌雄株开花的分子调控机理, 国内外未见报道。笔者克隆了银杏雄株LEAFY全长基因, 以比较银杏雌雄株LEAFY基因的异同, 为研究银杏开花的分子调控机理, 并通过转LEAFY基因来培育童期短的银杏奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

(1) 植物材料    以银杏品种大佛手雄株4月中旬幼嫩的叶片为材料提取基因组DNA, 采自浙江大学园艺系果园。(2)菌株和质粒    大肠杆菌(E.coli)TG1和质粒pUC19本实验室保存。(3)化学试剂    T4 DNA连接酶、pUCm-T载体、X-Gal、IPTG、dNTP、Taqplus DNA聚合酶均购自上海生物工程公司; 限制性内切酶购自Promega公司; DL2000 DNA Marker购自TaKaRa公司; 氨苄青霉素(Amp)购自华美生物工程公司。其他试剂均为国产分析纯试剂。(4)寡核苷酸引物    设计5对引物, 委托上海生物工程公司合成。引物如下:

上游引物1:5′ATGGATCCAGAAACTTTTCCTGC 3′    下游引物1 :5′TTCCTGAGAGAGTGTGTCCAACG 3′

上游引物2:5′ATGTTGATGGGAAGCGCAAGGCT 3′    下游引物2 :5′TTCACAGCACGAATACTCCTGTT 3′

上游引物3:5′CCCCATGGGTAATTTGTAACTTA 3′    下游引物3 :5′TGCATTGTCTCCCTGAGGTTCTT 3′

上游引物4:5′ATTATTCTTTCACAGAACACCTC 3′    下游引物4 :5′TGATACTCAACATTACATGGCAT 3′

上游引物5:5′ATGTTTTGGGAGCACTTACCGAA 3′    下游引物5:5′TCAATGAGGTTCTTGGCTTTTCT 3′

1.2 方法

(1) 基因组DNA与质粒DNA的提取    用改良CTAB法提取叶片基因组DNA作为模板。碱法小批量抽提质粒(Frederick et al., 1998)。(2)PCR扩增方法(在HYBAID PCR EXPRESS中进行)根据国外发表的银杏(品种不明)雌株LFY基因(Michael et al., 2000), 设计5对引物, 进行PCR反应。反应体系为:10 ×PCR缓冲液(不含Mg²⁺)5.0 μL, MgCL2(2.5 mmol·L^-1)4.0 μL, dNTP混合物(dATP, dTTP, dCTP, dGTP各自2.5 mmol·L^-1)4.0 μL, 上下游引物均为(10 μmol·L^-1)1 μL, 模板DNA(50 ng·μL^-1)1.0 μL, Taqplus酶(5个活性单位·μL^-1)0.5 μL, 加灭菌双蒸水至总体积50 μL。扩增参数为:94 ℃预变性5 min, 然后94 ℃, 40 s, 52 ℃, 40 s, 72 ℃, 60 s, 进行35个循环, 再72 ℃延伸10min。(3)DNA片段重组入质粒载体PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶上电泳, 同时点DL2000 DNA ladder, 用QIAquick胶回收试剂盒从凝胶上回收、纯化目的条带。将回收产物连接到pUCm-T载体上, 连接产物转化大肠杆菌TG1菌株感受态细胞, 通过蓝白斑筛选、PCR验证、质粒长度对比和酶切鉴定获得重组质粒(Sambrook et al., 1995)。(4)DNA序列测定    委托上海晶泰生物技术有限公司测序。

2 结果与分析 2.1 PCR产物的获得和克隆

用1、2、3、4、5等5对引物, 从银杏叶片基因组中相应地扩增出5个不同的DNA片段:A, B, C, D, E, 在1 %琼脂糖凝胶上电泳, 结果如图 1, 显示各片段长度分别为480 bp、700 bp、750 bp、800 bp、760 bp左右。用QIAquick胶回收试剂盒从胶上回收、纯化DNA。将纯化的DNA片段用pUCm-T载体连接, 连接产物转化大肠杆菌TG1菌株感受态细胞, 在含氨苄青霉素、X-gal及IPTG的LB平板上涂布转化细胞, 获得白色菌落。挑取这些菌落培养、提取质粒, 经长度对比(图 2)和酶切(EcoRI和Xho Ⅰ双酶切)(图 3)鉴定, 获得重组质粒A, B, C, D, E。

2.2 基因序列与同源性分析

测定重组质粒A、B、C、D、E的序列, 表明所克隆的DNA片段分别长480 bp、698 bp、751 bp、807 bp和774 bp。将所获得的基因片段序列拼接起来, 在genebank中进行检索, 发现该序列与文献报道的银杏雌株LEAFY基因核苷酸序列同源性高达99 %, 蛋白质序列同源性达99 %。序列首端有起始密码子, 末端为终止密码子, 我们推断是全长的LEAFY基因, 该全长基因核苷酸序列及推测的氨基酸序列如图 4。从内含子边界特征和多种植物LEAFY基因同源性比较, 确定了该基因的内含子位置。该基因含2个内含子, 3个外显子。与雌株LEAFY基困相比较, 雄株LEAFY基因少3个碱基, 突变均在植物LEAFY基因的非保守区内(图 4中阴影部分为植物LEAFY基因保守区)。

对于银杏的雌雄株的花芽形态分化已有报道(史继孔等, 1998; 张万萍等, 2001)。但从分子水平上研究银杏的开花调控机制, 尚未见报道。银杏雌雄株LEAFY基因序列的高度同源并不能说明LEAFY在银杏雌雄株体内的表达也很相似, 何况银杏雌株LEAFY基因的功能研究也还没有报道过。银杏作为一种很古老的雌雄异株的裸子植物, 其开花的调控可能是比较特殊的。另外, 从分子水平研究银杏的开花机理, 还有助于弄清植物开花功能的进化与演变。这些都需要进一步研究, LEAFY基因的成功克隆为此打下了一个很好的基础。