松球壳孢菌(Sphaeropsis sapinea, 异名Diplodia pinea)在世界上分布范围广, 由其引发的病害——松枯梢病危害十分严重。1980年以来, 中国数省(区)的多种松树均遭此病侵害, 有的导致树木大面积死亡。樟子松(Pinus sylvestris var. mongolica)为中国三北防护林工程和治沙工程建设的主要针叶造林树种, 近年来不断遭受松枯梢病侵袭, 病情逐年加重, 引起林木成片枯死。

关于松球壳孢菌的致病性国内外已有一些研究报道, 但在有些方面(如病菌的侵入途径)结果不尽一致, 特别是国内分歧较大。有人认为伤口是病菌侵入的必要途径(项存悌等, 1981;景辉等, 1986; Marks et al., 1969), 有人则认为病菌可直接侵入幼梢(梁子超等, 1980;刘毅平等, 1989;沈伯葵等, 1993; Chou, 1978), 还有人认为病菌可以从气孔侵入针叶(吴小芹, 1995; Brookhouser et al., 1971)。在美国, 松球壳孢菌有两种类型即A型与B型, 二者在致病性上有显著区别。A型致病性较强, B型无致病性或致病性较弱, 从而不被看作病害的起因(Palmer et al., 1987; Blodget et al., 1997)。为了进一步认识松枯梢病, 为防治提供依据, 以樟子松为主开展了一系列研究, 并首次进行中美菌株致病性对比实验。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株来源

几年来, 采用菌丝块或孢子液接种, 开展了一系列实验。用于菌丝块接种的国内菌株CH1-1、CH10-2、CH21-1、CH23-1和CH26-11均为单孢菌株, 来自辽宁省的樟子松病害木。美国模式A型菌株STA-1、STA-2和模式B型菌株STB-1、STB-2也为单孢菌株, 来自美国, 由威斯康星大学的Stanosz教授提供(详见表 1)。用于孢子液接种的孢子为野外自然形成, 采自辽宁章古台的樟子松。

1.1.2 寄主

所有实验均在辽宁省章古台的室外和野外进行。受试的寄主树种有樟子松、油松(Pinus tabulaeformis)、赤松(P. densiflora)、彰武松(P. densiflora var. zhangwuensis)等, 树龄4 ~ 30 a。

1.2 方法

菌丝块接种:将供试菌株在2 %水琼胶培养基上培养20 d(温度25 ℃), 然后切成直径为5 mm的圆块, 接种后用自粘塑膜(Parafilm)捆扎7 d。孢子液接种:孢子液浓度为低倍镜下每视野40个左右孢子, 用毛笔涂抹接种, 然后用浸水脱脂棉外加自粘塑膜捆扎7 d。除不同接种部位实验外, 其他实验均接种树木的当年生梢。

1.2.1 中美菌株致病性对比

于1998年7月下旬在室外4 a生樟子松容器苗上接种。对供试的5个国内菌株和4个美国A型和B型模式菌株采用菌丝块接种, 同时设置孢子液接种, 加对照共11个处理(见表 1)。完全随机区组设计, 3次重复, 每小区6株(3个刀伤接种, 3个无伤接种), 总计198株。

1.2.2 樟子松不同日期接种

1998 -06, 对10 a生樟子松做孢子液刀伤接种。孢子采自大树、1 a生播种苗和1997年人工接种感病针叶, 每种各接10个梢; 1998年7月末, 利用当年6月接种发病后新产生孢子又重复接种25个梢。自1999年5月11日起, 利用孢子液接种11 a生树木, 每隔1 ~ 2周接种1次, 共6次。设无伤+孢子、刺伤+孢子、无伤对照、刺伤对照4个处理, 每次每处理接种10个梢。

1.2.3 不同树种抗病性对比

1998年7月下旬, 用菌株CH1-1、CH21-1和CH23-1对野外20 ~ 30 a生樟子松、油松、赤松和彰武松进行菌丝块刀伤接种。每个树种接3株, 每个菌株在每株上接5个梢, 对照接无菌培养基因。2000年4月末至8月末, 每隔10 ~ 15 d接种1次野外20 ~ 30 a生樟子松、油松和赤松。采用孢子悬浮液接种, 设无伤+孢子、刺伤+孢子、对照(刺伤) 3个处理, 每次每处理接种5个梢。

1.2.4 树势与感病的关系

1998年7月下旬利用室外10 a生盆栽樟子松, 在同一轮枝上选两个侧枝, 其中一个于主干连接处用刀错位半环切, 以削弱其正常生理活动。然后在每个侧枝上选4个当年生梢, 分别做刀伤接种CH1-1、CH21-1、CH23-1的菌丝块和对照。共接种10对侧枝, 计80个梢。1999年6、7、8月初分别接种野外19 a生樟子松, 每次接种10株树。在每株树同轮侧枝中选2个大小、长势相似的侧枝, 将其中一个侧枝于基部半环割。在每个侧枝上用菌株CH1-1和CH23-1的菌丝块进行刺伤和无伤接种各1个梢, 同时设刺伤和无伤对照。

1.2.5 侵入部位与感病

为了解病菌侵入部位与发病的关系, 1998年7月下旬对18 a生樟子松分别枝(梢)龄进行了刀伤菌丝块接种。在每株树同一轮枝上选4个侧枝, 分别用CH1-1, CH21-1, CH23-1和对照于枝梢的1 a生、2 a生和3 a生处接种, 共接种7株, 总计84个枝梢。1999年7月上旬, 用菌株CH1-1分别在野外19 a生樟子松1 a、2 a、3 a梢上接种。设刺伤+菌块、刺伤对照2个处理, 每个处理接20个。

2 结果与分析 2.1 中美菌株致病性对比

有伤接种时, 除CH26-11的发病率居中等水平外, 国内其他菌株(CH)及孢子液接种的发病率与美国A型模式菌株(STA)相近且明显高于B型模式菌株(STB)。B型菌株之发病率与对照无显著差别, 基本无致病力; 无伤接种的结果比较复杂, 菌株CH1-1、CH23-1及孢子液接种的发病率较高, 与A型菌株无显著差异。CH10-2、CH21-1的发病率居中, CH26-11的发病率较低(见表 1)。

有伤接种与无伤接种的潜育期、繁殖期大体相仿。除B型菌株、CH26-11和孢子液外, 其他菌株在接后第8 d就有枯叶和分子孢子器出现, 但总体发病速度不尽一致, 国内菌株的潜育期和繁殖期比A型的短。B型的发病率很低, 最早观察到枯叶和分生孢子器是在接种30 d后。

研究表明, 国内供试菌株与类型A相近, 致病性较强。伤口并不是松球壳孢菌侵入的唯一途径, 但伤口可助长病菌的侵入与危害。类型B菌株无伤也可侵入, 但发病程度明显低于类型A。

2.2 樟子松不同日期接种

1998年10月中旬调查得知, 当年6月接种的发病率、枯梢率和病斑长平均为100 %, 55.2 %和5.6 cm; 7月末接种的相应为30.4 %, 4.3 %和1.2 cm。

1999年不同日期接种表明, 自新梢伸长至针叶发育完全期间(当地为4月下旬至6月下旬), 樟子松自身防御能力最差, 病菌可直接侵入当所新梢并使之枯萎。此后, 随着梢部组织的不断成熟与老化, 伤口对病菌的侵入与危害起着至关重要的作用, 无伤接种时不发病或只产生部分枯叶, 很少产生枯梢(表 2)。

2.3 不同树种抗病性对比

1998年刀伤接种发现, 油松、赤松的发病率、枯梢率相近, 明显低于樟子松的; 彰武松的发病率与樟子松相近, 但枯梢率较同龄樟子松低(见表 3); 4 a生樟子松的发病率特别是枯梢率显著低于18 a和23 a生的。1999 -10和2000 -08复查发现, 彰武松的发病率降低20 %左右, 原有的枯梢也只局限于1998年梢上, 基本不再发展。在其他树种上虽然也可见到类似情形, 但病害的加重还是显而易见的。

2000年不同日期10次接种表明, 松球壳孢菌可无伤侵入油松、赤松和樟子松, 伤口并不是侵入的唯一途径。实验当年, 3种松树无伤接种的平均发病率分别为10.0 %、11.7 %和51.1 %, 刺伤接种的平均发病率分别为36.4 %、31.7 %和74.1 %, 发病梢中自然产生分生孢子器的分别占10.5 %、10.5 %和87.3 %。在5月末以前的4次接种中, 刺伤无明显作用; 进入6月后, 伤口对病害的助长作用逐渐突出出来; 7月下旬以后, 无伤接种不再发病。油松和赤松再次表现出较樟子松抗病, 不但发病率比樟子松低, 而且病茵在油松和赤松上繁殖得明显不如在樟子松上容易、迅速。

2.4 树势与感病的关系

1998年有伤接种实验中, 环割侧枝与末环割侧枝的发病率均达100 %, 未环割侧枝的枯梢率略低于环割侧枝的。观察发现, 环割侧枝后病菌侵染的潜育期及繁殖期均比未环割的缩短, 且病斑较长。在接种后7 d后, 环割处理侧枝上70 %的接种梢便发病, 而未环割的相应为33 %(对照不发病)。

从1999年6、7、8月初3次接种当年的调查结果(见表 4)来看, 接种时间越早, 发病率越高, 潜育期和繁殖期越短(对照接种不发病)。6月初, 树木新梢正值展叶盛期, 比较幼嫩, 不论环割与否还是有、无伤接种, 半数以上的新梢在接种后7 d左右便呈现枯叶甚至枯梢, 20 d左右几乎全部染病, 只是在伤接种的枯梢率比无伤的要高; 7月初接种时, 针叶伸长停止, 新梢趋于老化, 虽然也有部分梢在接种后7 d左右发病, 但15 ~ 20 d时才达到当年发病的半数, 也是在此时才有枯梢出现。刺伤接种部位和环割侧枝基部的作用在这次接种中表现得最明显, 既不环割也不刺伤接种的发病率明显低于其他处理, 并多数仅表现为枯叶。虽不是直接刺伤接种部位, 但环割侧枝基部本身也使得病情加重, 说明树势削弱、生理紊乱后树木的防御机能降低, 抗病性减弱; 8月初接种的发病程度进一步降低, 无伤接种几乎不再产生枯梢且其发病率明显低于有伤接种。

2000-08对1999年的实验复查发现, 6、7月接种的发病率、枯梢率变化不大; 8月接种的, 二者均有所上升, 特别是发病率, 当年表现为健康的梢有23 %于第2年转变成枯叶并产生分生孢子器。6、7、8月接种产生的枯梢中死部明显加长的分别占15 %、40 %、60 %。7、8月份接种, 当年发病但未产生分生孢子器的多数于翌年形成分生孢子器。

2.5 侵入部位与感病

1998年接种表明, 不同接种部位接后7 d普遍发病(枯叶), 但以接种在1 a生梢部的发病率高。在1 a、2 a、3 a生部位接种最早出现枯梢的时间分别是接后7 d、30 d和44 d。病菌的繁殖期随接种部位年龄的增加而延长, 在1 a生梢上接生15 d, 72.2 %的发病梢产生分生孢子器, 而在2 a、3 a生部位接种的相应为15.4 %和7.1 %。当年10月份调查发现, 1 a、2 a、3 a生接种部位的发病率均达100 %, 枯梢率分别为90.5 %、38.1 %、9.5 %。1999 -10进一步观察发现, 发病率比1998年有所降低, 特别是接种部位在3 a生的。原因是1998年表现为健康的接种梢在1999年仍为健康, 而少数已产生枯叶的病叶脱落后病害没有继续发展而呈现为健康。不过, 1998年已发病的枝梢之病状多数在1999年进一步加重, 原为枯叶的病斑延长或发展为枯梢, 原为枯梢的枯死部分加长。

1999年接种表明, 病菌在1 ~ 3 a生梢部均可侵入危害, 接种当年发病率为72.7 %~ 100 %, 枯梢率为36.4 %~ 50 %。2000年复查发现, 病斑加长, 枯梢率升高。

3 结论与讨论

研究证明, 国内供试松球壳孢菌的致病力明显高于美国B型菌株, 与A型相似, 致病性较强, 是樟子松枯死的重要原因。Palmer等(1987)曾报道A型能无伤侵入而B型不能; Blodgett等(1997)则发现B型也能无伤侵入, 只是感病率偏低, 我们的实验结果与后者一致。

伤口并不是病菌侵入的唯一途径。自然梢伸长至针叶发育完全期间, 病菌可直接侵入当年嫩梢并使之枯萎。此后, 随着梢部组织的不断成熟与老化, 伤口对病菌侵入与危害的助长作用才逐渐显现出来, 无伤接种时不发病或只产生部分枯叶, 很少产生枯梢。病菌不但可无伤侵入樟子松, 而且也能无伤侵入油松和赤松, 伤口必要与否并未因树种的不同而改变。仔细研究国内外相关报道会发现, 那些得出可无伤侵入结论的多是在树木或苗木新梢幼嫩阶段进行接种的(梁子超等, 1980;刘毅平等, 1989;沈伯葵等, 1993; Chou, 1978);而那些认为是有伤侵入的几乎都是在新梢相对老化以后开展实验而错过了病菌可无伤侵入的那段特定时期或根本未设无伤处理(项存悌等, 1981;景耀等, 1986; Marks et al., 1969)。在研究病菌侵入是否需要伤口时, 正确设置实验时间是非常重要的。Brookhouser等(1971)研究认为, 松球壳孢菌可通过气孔侵入松树当年嫩叶, 当年针叶老熟后不易被侵入, 头一年老叶不能被侵入。吴小芹(1995)利用湿地松(P. elliottii) 2 a生针叶做扫描电镜观察, 认为气孔可能是病菌侵入的重要途径。沈伯葵等(1993)则推断, 不能从气孔侵入。我们的观察结果与Brookhouser的相近。松球壳孢菌不但可侵入树木的当年新梢, 而且还可于2 a和3 a生处有伤侵入, 使之染病甚至死亡。

染病的轻重、潜育期和繁殖期的长短与寄主、树势、组织的成熟程度和气温等有关。幼龄的樟子松较大龄的抗病。油松、赤松、彰武松较樟子松抗病, 而彰武松主要表现为“耐病”。同等条件下, 病菌在油松和赤松上的繁殖速度比在樟子松上慢。病菌侵入越早, 寄生组织越幼嫩, 当年发病及危害就越严重。环割侧枝使其生理紊乱、树势削弱、抗病性减弱, 不但使染病程度加重, 而且还使潜育期和繁殖期缩短。在野外, 潜育期多数在15 ~ 20 d, 最长可达数月。繁殖期多数在35 ~ 55 d, 最长也达数月。潜育期和繁殖期随寄主组织老化程度的增加及气温的降低等而延长。1999 -08接种当年表现为健康的梢约1 4于第2年变成枯叶并产生分生孢子器; 7、8月份接种, 当年发病但未产生分生孢子器的多数于翌年形成分生孢子器。因此可见, 当条件不利于病害发展时, 病菌可以菌丝形式在树体内或体表存在较长时间(以至越冬), 待条件适宜继续侵染与繁殖, 这便涉及到潜伏侵染问题。关于松球壳孢菌潜伏侵染问题, 国际上已有一些研究(Botes et al., 1996; Kowalski et al., 1992; Stanosz et al., 1997)。Stanosz等(1997)不但从健康的美国脂松和班克松的枝叶上分离到松球壳孢菌, 而且还确定了病菌的类型及致病性。但现有研究结果只能说明潜伏侵染是可能的, 对其长短尚无定论。我们的研究证明, 松球壳孢菌可在树木体内或体表潜伏数月。有关潜伏侵染的机理, 如潜伏期的开始、终结和影响因子(特别是树木的生理状况)等, 需进一步研究。