近年来国内外学者越来越重视豆科树木和根瘤菌共生体系的研究。研究发现, 有些固氮树木同时也是菌根营养型树种, 它们既可能有外生菌根, 也可能形成内生菌根(弓明钦等, 1997), 有些研究表明菌根对固氮作用具有增效作用(张美庆, 1994)。因此固氮树木这种多重共生的现象, 越来越引起人们的重视, 对固氮树木的这种多重共生现象及其利用也逐渐开展了较多的研究工作。但是目前对于豆科固氮树种双重共生仅限于相思属(Acacia)、合欢属(Albizzia)和雨树属(Samanea)等树种的研究。刺槐(Robinia pseudoacacia)是豆科固氮的重要树种, 它又同时具有内生和外生菌根(弓明钦等, 1997)。具有分布广, 适应性强, 耐干旱, 耐瘠薄, 生长快等特性, 并具有抗SO₂污染能力, 可以改善环境, 保持生态平衡。开展刺槐联合共生体的研究, 有利于有效利用大气氮素, 发挥共生固氮效益, 促进林木生产, 为绿化荒山植树造林服务。本文在半开放盆栽实验条件下定量研究了不同接种对刺槐生长、菌根菌的发育状况及结瘤固氮能力的影响, 选出了最佳的接种组合。对宿主植物、菌根菌、固氮菌之间相互作用及机理进行了探讨, 为刺槐的联合共生体接种技术在造林生产实践中, 尤其是在逆境条件下的应用提供了依据。

1 材料与方法 1.1 供试土壤

供试土壤取自中国科学院沈阳应用生态研究所树木园内40 cm以下土壤, 将其与河沙以2: 1比例混合后装入直径为20 cm的泥盆中, 每盆装2.5 kg, 另加过磷酸钙5 g。

1.2 实验处理

不加接种物(CK); 单接种根瘤菌336;单接种菌根真菌VAR; 单接种菌根真菌VAH; 单接种菌根真菌7994;单接种菌根真菌870191;同时接种内、外菌根真菌VAR +7994、VAH +7994、VAR +870191、VAH + 870191;同时接种内、外生菌根真菌、根瘤菌366 +VAR +7994、366 +VAH +7994、366 +VAR +870191、366 + VAH +870191。每处理重复5盆, 每盆5棵苗。

1.3 接种物来源及菌剂用量

根瘤菌: 336(Rhizobium), 分离于刺槐根瘤, 由中国科学院沈阳应用生态研究所微生物室提供。将其离心后的菌体按每毫升100棵苗的量接种(1000 r·min^-1, 5 ~ 10 min)。VA菌根菌: VAH(Glomus aggregatum)分离于沙棘林下根际土壤, VAR(Glomus mosseae)分离于刺槐林下根际土壤, 以富含孢子的扩繁土(6 ~ 8个孢子·g^-1)和被浸染的白车轴草根段(侵染率为48 %)的混合物为VA菌根菌菌剂, 每盆接种50 g。外生菌根真菌: 7994(劣味乳菇Lactarius insulsus), 870191(毛边华锈伞Hebeloma mesophaseum)。采用固体菌剂, 每盆50g。

1.4 刺槐种子处理

当年采集的刺槐种子(采集于中国科学院沈阳应用生态所生态树木园), 低温处理1周, 用升汞消毒灭菌15 min后置于28 ℃恒温箱中催芽。挑选健康、发芽良好的种子进行播种。先将内生菌根真菌和外生菌根真菌接种于盆中, 播入种子。小苗萌发1周后, 接种根瘤菌。6个月后进行测试。

1.5 生长指标及生理指标的测定

包括:株高、地径、鲜重、主根长、侧根数、结瘤量、固氮活性、叶绿素含量、净光合效率、叶片全氮量、叶片全磷量、菌根侵染率。乙炔还原活性采用乙炔还原法及改进方法(沈善敏等, 1983)进行测试; 叶绿素含量采用ANON法进行测定; 净光合效率采用CL-301PS光合作用测定仪进行测定; 叶片全氮含量采用凯氏定氮法进行测试; 叶片全磷量采用钒钼黄比色法进行测试; 菌根侵染率采用压片染色法(Philips et al., 1970)进行计数统计。

2 结果与讨论

由实验结果(表 2, 表 3)可知, 无论是接种菌根菌还是固氮菌均促进了宿主植物的生长(显著性检验见表 4, 表 5), 但各接菌组合对不同的生长及生理指标的促进程度均有所不同, 总的表现趋势是单接优于对照组、双接优于单接、而复合接种又优于双接。

2.1 菌根菌对刺槐生长的促进作用

VA菌根可以促进宿主植物对磷素的吸收, 改善植物的生长状况, 接种VA菌根真菌可以促进苗木菌根的形成并增进幼苗生长(李晓林, 1992)。本实验的结果(表 2~5)证实了接种VA菌对宿主植物的生长具有明显的促进作用, 同时, 接种不同的VA菌对宿主植物生长的促进作用程度不同。接种VAH的植株株高、地径、鲜重分别比对照高出10.77 %、15.60 %和2.33 %, 侧根数和侵染率分别高出对照12.35 %和37.5 %, 接种VAR的植株株高、地径、鲜重分别高出对照14.12 %、16.19 %和5.61 %, 侧根数和侵染率分别高出对照21.12 %和62.5 %。植株的长势与菌根的侵染程度呈正相关。随着菌根侵染率的提高, 植株叶片含磷量也有所提高, 接种VAH的植株的叶片含磷量比对照提高5.85 %, 接种VAR的植株叶片含磷量提高6.59 %, 说明菌根的侵染明显改善了宿主植物磷素营养状况。通过比较可以发现VAR是一种较好的共生菌种。其原因在于VAR分离于刺槐林下, 是刺槐的土著菌种; 而VAH分离于沙棘林下, 对宿主植物刺槐来说, 是一种新的共生菌种, 必须经过长期的进化才能达到协调一致。

外生菌根的存在增大了宿主植物的养分和水分的吸收面积, 而且外生菌根真菌在生长及共生过程中可产生多种生长刺激物质, 具有外生菌根真菌的植物产生磷酸酶的活性是无菌根植物的几倍(Hayman et al., 1975), 此外, 很多外生菌根还能产生草酸盐, 它与重金属Al、Fe螯合而释放出磷酸盐, 对植物吸收磷产生有利影响。我们选用刺槐林下分离的7994和870191, 接种后的植株都表现出较好的生长状况, 株高、地径、鲜重分别比对照高出7.52 %、18.83 %、4.58 %和15.19 %、19.45 %、4.79 %。随着外生菌根菌的侵染, 宿主含磷量也分别提高4.63 %和7.07 %, 可以看出870191促生作用较好。

从刺槐的净光合效率和叶绿素含量两项生理指标来看, 接种VAH的植株高出对照14.19 %和1.93 %, 接种VAR的植株高出对照14.66 %和4.83 %; 接种7994的植株高出对照7.34 %和9.85 %, 接种87910的植株高出对照10.62 %和10.06 %。菌根的形成增强了刺槐对营养元素的吸收、激素水平的变化, 从而使叶绿素的合成加快, 降解减慢。即在一定范围内叶绿素含量高, 光合效率就高。而光合效率的提高对于促进刺槐的生长、延缓叶片的脱落、提高其抗逆性具有重要意义。

2.2 根瘤菌对刺槐生长的影响

对刺槐接种根瘤菌336的结果(表 2~5)表明, 根瘤菌可以促进宿主植物对氮素的吸收, 促进植物的生长。接种后的植株株高、地径、鲜重分别比对照提高了12.60 %、11.09 %和4.79 %。同时, 在纯培养中筛选得到的根瘤菌336在盆栽实验中也表现了较好的促生效果, 说明其对宿主植物刺槐来说是一种较好的共生菌株。从反映固氮能力的指标来看, 接种刺槐根瘤菌对于固氮的影响极为显著, 在结瘤量、固氮活性以及植株全氮量上分别高于对照16.99 %、152.94 %和8.55 %, 这说明植株的良好长势与根瘤菌的结瘤固氮作用是分不开的。同时, 固氮菌也能很好的提高宿主植物的生理功能、增强其抗逆性, 接菌植物叶绿素含量和净光合效率分别高出对照13.88 %和6.95 %。

2.3 混合接种VA菌与外生菌对刺槐生长的作用

以往对菌根菌混和接种的研究基本上集中在内生菌根真菌之间或外生菌根真菌之间, 对于内、外生菌根真菌的联合接种的研究未见报道。我们针对豆科固氮树木——刺槐进行了双接菌实验, 结果表明(表 2~5):内、外生菌根真菌之间存在增效作用, 不同的菌种组合的效果不同, 这种增效作用必须建立在合理搭配的基础上。混合接种VAR+7994、VAR +870191植株生长最好, 株高、地径和鲜重分别比对照增加25.05 %、19.44 %、5.85 %和28.64 %、24.05 %、5.98 %, 同时, 植株的净光合效率和叶绿素含量提高了15.25 %、20.66 %和11.20 %、20.64 %, 优于任何一种单接菌的效果, 菌根侵染率也分别提高了80 %、100 %, 叶片含磷量分别提高了7.07 %和8.54 %, 其它的各种组合未发现比单接种有明显的优势。可见VA菌和外生菌混合接种的增效作用源于优良菌种及其综合优势, 开展VA菌和外生菌根真菌之间的混合接种研究具有现实意义。

2.4 菌根真菌与根瘤菌的联合增效作用

菌根真菌与根瘤菌在长期的进化中形成了与宿主植物的联合共生体, 追溯共生的起源在于对逆境的适应, 随着自然选择作用, 共生体由最初的单方受益逐渐演化为协同进化(陈加宽等, 1994), 在生长和发育过程中体现了不可替代的优越性。

实验结果证明, 菌根菌与固氮菌双接种对宿主植物的生长起到了良好的促进作用, 同时接种VA菌、外生菌根菌和固氮菌的刺槐生长指标株高、地径、生物量上都比其相对应的单接种固氮菌、单接种菌根菌及VA菌与外生菌的混合接种要好, 这充分说明对宿主植物刺槐生长的促进作用是菌根菌和固氮菌综合作用的结果。其中接种根瘤菌366 +VAR+870191的共生优势最为明显, 接菌植株的株高、地径、鲜重分别比对照高出36.12 %、34.21 %和12.77 %, 净光合效率和叶绿素含量高出对照23.55 %和20.99 %。而这与最佳的促结瘤固氮能力、最佳的促菌根发育的组合一致。

混接菌根菌与根瘤菌不但促进了菌根菌的发育, 而且提高了根瘤菌的结瘤固氮能力, 在两者之间存在着正相关。首先, 通过对比单接根瘤菌和混接根瘤菌与菌根菌的植株可以发现:单接根瘤菌336的植株叶片含氮量、结瘤量和固氮活性分别比对照高出8.55 %、17.00 %、152.94 %, 而混接菌的植株几种组合的平均值分别高出对照10.41 %、58.73 %、232.16 %, 结瘤固氮能力明显提高; 与此相对应, 单接根瘤菌的植株叶片含磷量、侧根数和菌根侵染率分别比对照高出7.07 %、15.24 %、12.50 %, 混接菌则平均高出15.85 %、25.93 %、100 %, 可以看出根瘤菌的结瘤固氮能力与菌根菌的发育状况之间的相互增效作用。再通过对比单接菌根菌、双接菌根菌和混接菌根菌与固氮菌的植株可以进一步发现:混接菌的植株其叶片含磷量、侧根数和菌根侵染率都优于单接菌根菌、双接菌根菌的植株, 其叶片含氮量、结瘤量、固氮活性这几项反映固氮能力的指标也最高, 再次体现出明显的协同增效作用。

3 结论

菌根真菌明显促进了刺槐的生长, 但不同的菌种促进效果不同。比较而言, VAR是一种较好的内生菌根真菌, 870191是较适宜的外生菌种, 接菌的植株株高、地径、鲜重、净光合效率、叶绿素含量分别提高了14.12 %、16.19 %、5.61 %、4.83 %、14.66 %和15.19 %、19.45 %、4.79 %、10.62 %、10.06 %。

根瘤菌通过结瘤固氮作用促进了刺槐的生长, 接种根瘤菌336的植株株高、地径、鲜重、净光合效率、叶绿素含量分别比对照提高了12.60 %、11.09 %、4.79 %、6.95 %、13.88 %, 也同时表明了根瘤菌336是较好的共生菌种, 可用来进行造林育苗。

内生菌根真菌和外生菌根真菌的混和接种对刺槐具有增效作用, 但不同菌种搭配的效果不同, VAR +870191效果最佳, 接菌植株的株高、地径、鲜重、净光合效率、叶绿素含量分别比对照提高了28.64 %、24.05 %、5.98 %、11.20 %、20.64 %。

菌根真菌与根瘤菌的混合接种对宿主植物的生长具有协同增效作用, 但不同菌种的组合促生效果不同。对刺槐来说, 根瘤菌366 +VAR +870191是最佳的组合, 接菌植株的植株株高、地径、鲜重、净光合效率、叶绿素含量分别比对照提高了36.12 %、34.21 %、12.77 %、23.55 %、20.99 %。