林木杂交育种在林木遗传育种中的主导地位、辉煌成就和发展趋势都迫切要求改变林木杂种优势研究十分薄弱的局面并在杂种优势机理研究上取得突破, 以便更有效地预测、创造和利用杂种优势。叶培忠先生于1963年在世界林木杂交育种史上首次开展了我国庐山种源的马褂木(Liriodendron chinense(Hemsl.)Sarg.)与明孝陵的一株原产北美而种源不详的北美鹅掌楸(L.tulipifera Linn.)的正反交试验, 从而培育出杂种马褂木(南京林产工业学院林学系育种组, 1973)。随后多年重复进行的杂交和引种试验充分证明了这对组合具有很强杂交亲和力和强大生长、抗性和适应性杂种优势(南京林产工业学院主编, 1980; 赵书喜, 1989; 武慧珍, 1990; 廖舫林等, 1990; 刘洪谔等, 1991; 张武兆等, 1997)。本文在前人工作基础上, 首次开展了满足严密遗传设计与环境设计要求及拓宽了北美鹅掌楸遗传基础条件下的杂交试验; 做了正反交并突出了反交以及回交和F₁间杂交; 进行了杂种优势的遗传分析; 探讨了杂种优势机理。希望为科学制定杂种马褂木杂交育种策略和深入研究林木杂种优势表现与机理提供有用资料。

1 材料与方法 1.1 亲本选择和遗传设计

规定马褂木×北美鹅掌楸为正交。按照选育山地造林型和园林绿化型2类优良无性系的杂交育种目标和亲本选择原则, 选择4株马褂木(C₁、C₃、C₄、C₅)、9株北美鹅掌楸(t₁ ~ t₉)、3株正交F₁植株(F、B、b)和1株反交F₁植株(F_1(-))作为亲本株。其中C₁、C₃、C₄、C₅和t₅为先生早期杂交原始亲本株。采用析因设计(正交、反交、回交和F₁间杂交)和自由授粉设计¹⁾。

1) 叶金山.鹅掌楸杂种优势的生理遗传基础.南京林业大学博士学位论文, 1998.

1.2 花粉生活力测定

采用固体培养基法测定所有杂交亲本末花期的花粉生活力¹⁾。

1.3 控制授粉

采用不套袋的人工去雄控制授粉的树上杂交法于1996-04-30 ~ 05-19完成了109个杂交组合、每组合10朵花的杂交试验¹⁾。

1.4 种子检验

应用X法检验风干并去翅的全部杂交种子和每株亲本随机抽取的1600粒自由授粉种子的饱满度¹⁾。

1.5 环境设计

随机区组设计, 8株小区45个家系。其中27个家系重复5次(试验1), 21个家系重复4次(试验2), 株行距20 cm×20 cm。统一规定以自由授粉家系C₃为对照¹⁾。

1.6 生长性状调查

利用美国产LI-3000 Portable area meter在1997-10-20 ~ 11-09测量单株总叶面积, 并计数单株叶片数; 11-20 ~ 11-25测量单株地径和苗高; 1995 ~ 1998年连续进行物候期野外观察。

1.7 光合测定

采用美国CID公司CI-301型CO₂气体分析系统于1997-09-12 ~ 14测定光合实验1 ~ 4叶片的光量子通量密度(PFD)和净光合速率(Pn)等指标¹⁾。

1.8 统计分析

按竞争优势法估算杂种优势率; 按随机区组固定模型进行以单株性状值和以小区平均数为单位的一元和多元方差分析; 采用两总体t检验法分析光合实验1 ~ 3的Pn并按多元方差分析模型分析光合实验4的Pn; 按固定模型估算杂交种子饱满度性状配合力; 按随机区组固定效应模型估算生长性状配合力; 按析因设计公式估算单株狭义遗传力¹⁾。因损失了一些杂交组合苗, 因而只对配合力和遗传力做了简单估算。全部统计分析采用SAS软件。受制于篇幅, 本文省略了博士论文中的统计分析表格。

2 结果与分析 2.1 杂交亲和性

所有杂交亲本末花期的花粉都具有生命力并且花粉生活力存在较大变异性。正交、反交、回交和F₁间杂交4种交配系统的杂交亲和性变异很大, 并都能得到杂交种子和杂交幼苗, 这与叶培忠在正反交研究中得出的结论一致(南京林产工业学院林学系育种组, 1973)。根据8点事实认为本次杂交试验不存在外源花粉污染, 因而杂交获得成功并得到真正杂种; 此外, t₇在正交和回交中的杂交亲和性明显低于反交和F₁间杂交, 而在反交和自由授粉中基本呈现杂交不亲和性, 说明t₇不适合于做母本¹⁾。鹅掌楸属种间杂交是否真正存在杂交不亲和的组合有待于进一步研究。就自由授粉种子饱满度而言, 马褂木个体变异较大, 从C₁的0.52%直到C₃的10.02%, 并且普遍高于北美鹅掌楸和杂种F₁, 这与尹增芳等认为南京地区马褂木自然状态下结籽粒尚不足1%的结论不完全一致(尹增芳等, 1994)。

2.2 杂种优势分析

所有参试家系4类生长性状的平均值、标准差、变异系数和杂种优势率数据都清楚表明杂种1a生幼苗的生长性状在家系间和家系内均存在较大遗传变异性, 其中除试验1中3个回交家系(B×t₅、N× t₅、F_1(-)×t₁)和试验2中1个回交家系、1个F₂家系和1个自由授粉家系(F_1(-)×t₆、B×F_1(-)、B)的地径性状平均值低于对照而呈负向杂种优势外, 其它生长性状平均值都是马褂木自由授粉对照最低, 所有杂交家系都具有明显生长正向杂种优势。试验1的24个杂交家系中, 地径具正向杂种优势的杂交家系21个, 占87.5%;地径杂种优势率变幅为-11.63%~ 44.12%, 变异系数变幅为20.07%~ 36.64%;苗高、叶片数和叶面积性状杂种优势率变幅分别为23.72%~ 180.73%、17.62%~ 173.34%和39.78%~ 367.25%, 变异系数变幅分别为34.84%~ 78.74%、49.41%~ 92.99%和53.87%~ 104.30%。试验2的17个杂交家系中, 地径具正向杂种优势的杂交家系有15个, 占88.2%;地径、苗高、叶片数和叶面积性状杂种优势率变幅分别为-14.39%~ 52.40%、48.82%~ 297.92%、61.66%~ 344.80%和60.95%~ 651.42%, 变异系数变幅分别为20.66%~ 52.97%、23.39%~ 84.40%、33.15%~ 101.11%和36.20%~ 138.94%。统计数据说明, 大多数回交家系正向生长杂种优势十分显著, 杂种优势率变异幅度大于正交; t₅做父本的回交引起杂种优势的减退; 所有杂交家系1 a生幼苗均具明显叶面积杂种优势¹⁾。

以单株性状值和以小区平均数为单位的一元和多元方差分析证明2个试验的幼苗生长性状在家系间存在明显差异, 其中除试验2的一元方差分析中以小区平均数统计的叶面积性状差异在家系间达显著水平外, 其余情况下生长性状差异在家系间均达极显著水平¹⁾。

Duncan分析揭示出5点规律:(1)自由授粉家系间生长性状无显著差异。(2)正交、反交、回交和F₁间杂交4种交配系统家系的生长性状都与对照存在显著差异, 并且正交、回交系统内的不同家系间也存在显著差异; 少数回交家系与正交家系存在显著差异。(3)两组正反交(C₃×t₆、t₆×C₃与C₁×t₆、t₆×C₁)家系生长性状无显著差异。(4)1个F₂家系(B×F_1(-))与多数正交、反交和回交家系不存在显著差异。(5)2个试验中苗高排列前6位家系的其它生长性状也处于前列, 并且性状间无显著差异而与对照均有显著差异, 同时满足育种目标, 因而以95%的概率保证, B×t₂、n×t₂、C₁×t₅、F_1(-)×t₆、C₁×t₁、F×t₄、C₁×t₆、t₆×C₁、F_1(-)×t₅和C₅×t₁为10个优良家系, 其中又以B×t₂和n×t₂最优¹⁾。

以单株性状值和以小区平均数为单位的相关分析证明幼苗地径、苗高与叶片数和叶面积呈高度正相关, 其中地径、苗高与叶片数的表型偏相关系数大于0.7, 而与叶面积的表型偏相关系数更高, 叶片数与叶面积的也较高(>0.8)¹⁾。相关分析不但说明了杂种马褂木在生活史最早期的生长与叶面积间杂种优势高度相关, 也揭示了杂种马褂木杂种优势形成机理与光合作用密切相关。

在PFD变化较小的情况下, 杂种与母本1 a生实生苗的Pn指标均表现出较大变异性, 其中按平均Pn比较, C₄×t₅高于C₄的16.48%, C₅×t₂高于C₅的7.39%, 而一组正反交F₁则差异较小, C₃×t₆仅比t₆×C₃高出3.21%, 由此可见在光合强度方面正交F₁高于母本以及正交F₁稍高于反交F₁。光合实验4中正反交F₁和双亲的1 a生嫁接苗虽然Pn指标变化很大, 但四者之间平均Pn的差异却非常小。单元和多元方差分析证明4种光合实验中的杂种和亲本间Pn差异没有达到显著水平, 因而杂种在9月中旬测定时没有表现出显著光合强度杂种优势1)。尽管如此, 由于叶面积的杂种优势特别强大, 因而杂种只要表现出非常微弱的光合强度优势也就会极大地提高光合产量优势。

2.3 光合优势假说

叶面积是影响生长发育的直接性状, 而所有试验苗在整个生长期内受光充分, 叶片间不遮光, 苗期叶片都是生产器官, 因而杂种幼苗显著生长杂种优势必然直接来源于强大叶面积杂种优势。田间观察发现1 a生杂种苗与马褂木自由授粉对照苗存在许多明显不同的生物学表现:杂种幼苗早期叶片小而多并全部宿存, 而幼苗中、后期叶片数急剧增多, 单叶面积显著增大, 多数单叶面积达400 ~ 700 cm²; 到测定时(10-20 ~ 11-09)仍然一片翠绿, 直到早霜(11-13)袭击后叶色才突然变黑, 并在4 ~ 5 d内全部脱落。与此形成鲜明对比的是对照苗早期叶片更小更少并全部脱落, 而幼苗中、后期叶片数量很少, 单叶面积远小于杂种叶片、一般仅为10 ~ 50 cm², 到测定时早已普遍发黄, 叶片失水变脆、边缘卷曲并形成离层即将脱落, 明显处于衰老后期阶段, 因而对照苗的光合时间明显短于杂种苗。1998年物候期田间观察发现2 a生杂种苗仍具有发叶早、前期叶面积增长快、单叶面积大、叶片数量多、后期叶片衰老慢、保持最大叶面积时间长等显著特点, 因而呈现出比1 a生杂种苗更强大的叶面积优势以及地径和苗高优势, 而对照苗则明显受压; 2 a生杂种苗生长性状的家系间和家系内变异急剧增大; 少数优良单株地径超过3 cm, 苗高达到3 m。1995 ~ 1998年对南京地区杂种与双亲成年大树物候期的连续观察也表明马褂木发叶约迟于杂种和北美鹅掌楸一星期; 5月中旬少量叶片已出现轻微失水、叶色渐黄、叶缘微卷等衰老特征; 以后变黄叶片急剧增多并落叶; 9月中旬全树1/5 ~ 1/3的树叶已变黄, 并开始大量落叶。但杂种和北美鹅掌楸在整个夏季全无落叶现象, 全树叶片始终翠绿, 直至深秋低温来临时才落叶。北美鹅掌楸叶片在夏末秋初逐渐发黄, 但杂种叶片至脱落前无发黄现象并且落叶最迟, 一般都是临近早霜气温剧烈降低或遭早霜袭击才突然变黄并在几天内集中脱落, 而杂种幼苗落叶又比成年树迟。观察比较其它引种区不同年龄的成年树, 杂种与双亲相比最惹人注目的外观特征无疑就是树冠更庞大浓密、单叶更大、叶片更多和叶色更深。总之, 杂种拥有比马褂木绝对强大的光合面积和光合时间双重杂种优势。综合考虑叶面积性状杂种优势表现和生长杂种优势与叶面积的相关性, 有理由认为杂种幼苗在生长后期可能主要依靠光合面积和光合时间两因素的复合优势效应, 而不是主要依靠光合强度优势来维持光合产量优势的。Duncan法所证明的2组正反交杂种幼苗的4个生长性状不存在显著差异以及C₃×t₆与t₆×C₃在9月中旬测定时光合强度也没有显著差异2点事实更进一步说明光合面积和光合时间的复合优势效应是维持杂种幼苗生长优势的主要作用。深入分析杂种幼苗拥有庞大叶面积的事实, 植物生理学上支持杂种幼苗在生长前期和中期很可能或必然存在光合强度优势的推论。这种推论的合理性非常明显, 否则理论上无法解释落叶性的杂种马褂木幼苗何以能够在生长前期和中期的较短时间内迅速建立起如此庞大叶面积以及地径、苗高和叶片数性状的明显优势。此外, 从杂种与马褂木叶片衰老表现的巨大差异性上也能从逆境生理学上看出杂种在生长后期的一个或长或短时间里肯定具有或大或小的光合强度杂种优势, 因为就单叶而言, 发黄叶片的光合强度是根本无法与翠绿的杂种叶片相比的。

光合生理学已经阐明生物产量是植物一生中所生产的总光合产量减去植物一生中主要通过呼吸作用所消耗的有机物, 而光合产量又决定于光合面积(叶面积)、光合强度和光合时间3个因素。即光合产量=光合面积×光合时间×光合强度-代谢消耗。上述研究已经明确证明杂种幼苗与成年树均具有光合面积和光合时间的杂种优势, 并从理论上推测杂种幼苗在生长前期、中期和后期很可能或必然具有光合强度杂种优势以及杂种成年树的光合强度表现可能与杂种幼苗类似。此外, 我们在博士论文的有关杂种马褂木杂种优势形成机理的研究部分已经证明杂种拥有水分胁迫抗性的超亲杂种优势和水分胁迫对马褂木光合作用危害最大(另文发表), 并证明杂种叶片具有解剖结构的超亲杂种优势¹⁾。

1) 叶金山.鹅掌楸杂种优势的生理遗传基础.南京林业大学博士学位论文, 1998.

这些研究结果实际上综合反映了与亲本特别是马褂木相比, 杂种在性状遗传、形态结构和生理生化等方面具有许多有利于改善和提高光合产量的因素。这些有利因素的复合效应造成杂种的光合优势并最终导致生长、抗性和适应性杂种优势。我们根据自己对杂种马褂木杂种优势所做的有限研究, 并分析杂种优势研究的历史资料, 初步提出“光合优势假说”(photosynthetic superiority hypothesis)作为杂种马褂木和其它杂种树木杂种优势机理的理论解释。光合优势假说的中心思想可表述为:生长在自然界中的树木经常遭受到各种自然逆境的胁迫并对之做出应激反应; 林木杂种优势产生的根源就在于杂种与亲本普遍存在的对自然逆境胁迫响应和适应的差异性, 而在众多的差异性中又以光合作用的差异性最重要; 与亲本相比, 胁迫状态下的杂种树木在物质代谢、能量转化、信息传递和形态建成等方面存在一些有利于改善或提高光合作用的因素; 这些有利因素的复合优势效应导致光合能力优势并最终促使杂种表现出生长、发育、产量、抗性和适应性等方面的杂种优势; 这些可以存在于杂种树木各种生命结构层次中的有利因素在非胁迫环境中可能不起作用或作用不大, 但在胁迫环境中却发挥着很大作用。这种基于有限事实而初步提出的假说有待于进一步补充、修改、完善甚至被推翻。

2.4 遗传参数的简单估算

统计数据表明正交、反交和回交的种子饱满度以及正交F₁1 a生苗木的地径、苗高、叶片数和叶面积的一般配合力和特殊配合力都表现出较大遗传变异性; 随着交配类型和性状的不同, 狭义遗传力变化很大并且回交子代普遍高于正交子代¹⁾。这些遗传参数为杂种马褂木的遗传改良提供了重要信息。

1) 叶金山.鹅掌楸杂种优势的生理遗传基础.南京林业大学博士学位论文, 1998.

3 结论

正反交F₁、BC₁和F₂ 4种交配系统的杂交亲和性都较高并都能得到饱满杂交种子和健壮杂交苗, 而且杂交亲和性变异很大。杂交亲本的自由授粉种子饱满度变异也较大。鹅掌楸属种间杂交可能存在杂交不亲和的组合。

杂种1 a生幼苗4类生长性状在家系间和家系内均存在较大遗传变异性; 除个别家系的地径性状出现负向杂种优势外, 其余3类生长性状平均值都是马褂木自由授粉对照最低; 所有杂交家系都具有明显正向生长杂种优势。方差分析证明生长性状差异在家系间达极显著水平。Duncan多重比较证明马褂木自由授粉家系间生长性状无显著性差异; 4种交配系统杂种家系的生长性状都与对照有显著性差异, 并且正交、回交系统内的不同家系间也存在显著差异; 少数回交家系与正交家系存在显著性差异; 两组正反交家系生长性状无显著性差异; 大多数回交家系正向生长杂种优势十分显著, 杂种优势率变异幅度大于正交家系; 明孝陵的北美鹅掌楸原始亲本株做父本的回交引起杂种优势的减退。一个F₂家系生长性状与多数正交、反交和回交家系不存在显著性差异。因而家系选择、单株选择以及BC₁和F₂利用潜力很大。相关分析证明地径、苗高与叶片数和叶面积呈高度正相关, 杂种幼苗显著叶面积杂种优势直接造成了强大的地径和苗高杂种优势。杂种幼苗在生长前期、中期和后期具有光合强度杂种优势, 而光合面积和光合时间的复合优势效应是杂种形成强大生长优势的主要原因。

正交、反交和回交的种子饱满度性状、正交F₁1 a生苗木4类生长性状的一般配合力和特殊配合力均表现出较大变异性; 正交和回交子代生长性状的狭义遗传力随着交配类型和性状的不同而变化很大并且回交子代的狭义遗传力普遍高于正交子代。

整个研究最终说明了鹅掌楸属正交、反交、回交和F₁间杂交4种交配系统的杂种马褂木幼苗普遍具有正向生长杂种优势和杂种生长性状存在家系间与家系内的广泛变异以及回交家系表现优良, 同时初步提出“光合优势假说”作为杂种马褂木和其它杂种树木杂种优势形成机理的理论解释。这些结果是对叶培忠先生研究的继承和发展, 并充分表明鹅掌楸属种间杂交育种具有广阔前途。