回交群体是谱系清楚的一对双亲经控制授粉产生的子代, 其遗传物质经自由组合、连锁互换及等位基因的分离, 在群体足够大的情况下, 所有组合的表型均得以表现。因此是遗传学研究的良好材料。本文以树高、地径作为生长量参数, 以杨柳科植物主要的次生代谢产物———杨柳酚甙含量为指标研究次生代谢物质变化情况, 以探究植物次生代谢物积累与生长的相互关系, 其结论可在一定程度上回答2个问题:植物防御是否必须以减缓生长为代价?能否在后代中选出生长既好防御性物质含量又高的个体?本文选择酚甙类化合物为主要研究对象是有较深厚理论依据的。欧洲和北美对杨柳科植物体内的次生物质进行了比较深入的研究, 几十年的研究表明, 杨柳科植物中的特异次生代谢产物是一类被称之为酚甙的物质(Palo, 1984)。酚甙类物质是由莽草酸途径产生, 由酚羟基与糖或糖的衍生物结合而成, 甙在生物化学中又常被称为苷。这类物质现已分离鉴定的有近20种, 在杨柳科不同的种属间存在广泛的多态性, 并已证实此类化合物的含量受遗传控制(Hwang, 1997)。其中以水杨甙(salicin)、柳皮甙(salicortin)、2″-苯甲酰水杨甙(tremuloidin)、颤杨甙(tremulacin)较为丰富(结构见图 1), 研究也较多。近几年人们之所以对这类物质的关注有增无减, 主要有以下2个原因:1.酚甙是研究杨柳科植物与植食性动物、昆虫、真菌关系中最重要的化学物质(Edward, 1978; Tahvanainen, 1985; Rowell-Rahier, 1984; Hoof, 1989)。一方面, 酚甙影响动物、昆虫的取食、食物消化、生长发育; 另一方面, 又是一些昆虫体内所分泌防御性化学物质的前体, 详见下文。2.酚甙类物质有种属的差异性, 受遗传控制, 可作为分类标记。我国已有学者对我国乡土树种———毛白杨(Populus tomentosa)中的酚甙类物质进行过初步的研究(马天波, 1987; 林茂, 1993; 魏舜明, 1985), 但以植物防御为研究目的的尚未见报道。本文以我国20世纪70年代广泛引种的美洲黑杨为研究材料, 在酚甙研究中加入了对美洲黑杨特有的美洲黑杨甙(deltoidin)的分析。

1 材料与方法 1.1 植物材料

采用美洲黑杨优良无性系I-69〔Populus deltoides Bartr.Cl.“ Lux”(I-69/55)〕为母本, 与另一优良无性系I-63〔Populus deltoides Bartr.Cl.“Harvard”(I-63/51)〕为父本杂交产生后代, 从后代中选择优良无性系34-135, 然后与I-63回交, 获得回交后代93个系号, 每系号3株, 现为2 a根1 a生实生苗, 生长于中国林业科学研究院苗圃内。

1.2 生长调查

分别于1998、1999年秋天生长结束后实测回交苗的树高与地径。

1.3 材料的前处理

1998-08分别从每一系号采集从顶部下数第5片生长成熟的叶片、并从植株中部树皮上剥取5 cm ×0.5 cm的树皮1块, 迅速投入液氮, 然后放入-40 ℃的冷冻干燥机内干燥24 h。在0 ℃冷室内用研磨机将材料研成粉末, 放入-20 ℃的冰箱内待用。将材料用冷甲醇提取(20 mg材料·mL^-1甲醇), 提取时超声振荡器振荡10 min, 振荡器内加入冰块, 以防止材料解冻。用0.5 μm的滤膜过滤提取液, 然后用高压液相色谱(HPLC)测定材料中酚甙类化合物的各类与成分, 酚甙类化合物标样由法国农艺研究所Sylvie Augustin博士提供。

1.4 液相色谱法(HPLC)条件

色谱柱:Merch lichosopher 100RP18 encapped column; Waters486紫外检测器UV274 nm0.1×AUFS; 流动相:CH₃OH:CH₃CN:H₂O(38:10:52), 用磷酸调pH=3.5;流速:0.7 mL·min^-1。

1.5 机械伤害对酚甙诱导作用的实验

以植物树皮为研究对象, 在主干取树皮48 h后, 在伤口边缘再取与第1次取样约相同大小树皮一块, 其它处理与以上相同。

1.6 统计分析

采用SPSS9.0软件相关功能。频数分析:Analyze-Descriptive Statistics-Frequencies; 相关分析:AnalyzeCorrelate-Bivariate-Pearson(积差相关); 方差分析:Analyze-Compare mean-One Way ANOVA。

2 结果与分析 2.1 生长量与酚甙类化合物的变异

将93个系号分别测定其生长与酚甙类化合物的种类含量, 结果见表 1和图 2, 苗高与地径的分布呈正态分布。对于酚甙类化合物, 在所有植株的叶片中测到5种酚甙类化合物的存在, 其差异只是数量上的差异, 而非种类上的差异。在5种酚甙中, 以柳皮甙含量最多, 占总量的48.85%, 其它依次为美洲黑杨甙24.59%, 水杨甙13.51%, 2″-苯甲酰水杨甙6.58%, 颤杨甙6.48%。

2.2 生长量与酚甙化合物的相关性

对于主要酚甙柳皮甙和总酚甙含量与植株高与地径作相关分析, 其相关情况:柳皮甙与生长量r = -0.227, P =0.028, 以置信区间0.05达显著水平; 与地径r =-0.107, P =0.308, 相关不显著。总酚甙与生长量r =-0.304, P =0.003, 以置信区间0.01达显著水平; 与地径r =-0.178, P =0.088, 相关不显著。

2.3 机械致伤对酚甙类物质的诱导作用

选择26个无性系, 在主干中部剥取树皮48 h后, 再取伤口周围树皮, 进行化学分析, 比较致伤前后酚甙类物质含量变化情况。在树皮中只测到3种酚甙类物质:水杨甙、柳皮甙、美洲黑杨甙, 其中以柳皮甙为主占总量的67.27%。从图 3看, 机械致伤对酚甙类物质有明显的诱导作用, 所有3种酚甙类物质均有增加, 只有柳皮甙的增加达到显著水平(F =17.833, P =0.000), 水杨甙(F =5.866, P =0.019)、美洲黑杨甙(F =6.871, P =0.012)均未达显著水平。表 2列出了柳皮甙和总酚甙致伤前后含量变化情况, 致伤后柳皮甙增加78.9%, 总酚甙增加60.69%。

3 讨论 3.1 酚甙的含量是数量性状

酚甙类物质属植物次生代谢产物, 大多不再参加代谢活动。次生代谢物产生是整个合成途径中大量酶协同作用的结果, 参与合成的所有基因必须在整个路径中协同作用才能得到产物。合成体系之外的酶在含量和活性的变化都可能对次生代谢的表型产生重要影响; 基因表达产物涉及到酶的结合、转运、在贮藏器官内积累等等, 都可能造成次生代谢产物在可观测到的数量上的变化。鉴于单基因经常只表明某产物的有或无, 而数量性状经常反映多个基因的共同作用, 因此此类研究更倾向于数量遗传研究方法。从本实验结果看, 几种酚甙的变异只是在含量上的变化, 变异模式属较典型的数量方式。

在杨柳科植物酚甙类物质的研究中本来完整的酚甙, 如柳皮甙和颤杨甙(多数研究者倾向于把这2种酚甙作为起防御作用的主要物质), 才对昆虫有作用。研究表明:酚甙在活体内代谢稳定, 而在离体(in vitro)状态下易于分解(Ruuhola, 2000), 因此材料的前处理是否适当常常影响测定结果, 早期的研究通过复杂的前处理, 测定到的物质均为其分解产物水杨酸、儿茶酚等, 故不能说明问题。因此在本研究中采用低温与冷冻干燥相结合的方式, 尽量使结果反应植物材料真实的情况。

3.2 酚甙类物质是防御性物质

酚甙类物质是杨柳科植物最具特色的一类物质。本文所涉及的杨柳酚甙在其它植物中一般不存在。多数研究者一致把这类物质看作防御性物质。Edward(1978)发现酚甙可影响负鼠(Trichosurus vulpecula)对杨柳科植物的取食。颤杨(Populus tremuloides)的萌条比成熟的枝条含有较高水平的酚甙, 这一特性可使之免受野兔等对它的伤害(Tahvaninen, 1985; Reichardt, 1990)。有研究报道酚甙对导致颤杨溃疡病的真菌(Hypoxylon spp.)有负作用(Hubbes, 1966; Flores, 1979)。近几年对酚甙研究最多的还是这类物质对昆虫的影响。研究表明, 一些种类的酚甙在一定浓度下对昆虫的幼虫存活率、取食、中肠酶的活性等有负作用, 研究的昆虫为一些鳞翅目昆虫, 包括:北美黑条黄凤蝶(Papilio glaucus)(Scriber, 1989)、大杨卷蛾(Choristoneura conflictana)(Bryant, 1987)、森林天幕毛虫(Malacosoma disstria)、舞毒蛾(Lymantria dispar)(Hemming, 1995)等。在对柳树昆虫的研究中, 很多学者发现酚甙与一些鞘翅目甲虫的生活习性密切相关。欧山杨叶甲(Chrysomela tremulae)和蓝绿弗叶甲(Phratora vitellinae)喜欢取食酚甙类物质丰富的柳树种———解释是昆虫分泌的用以防御天敌的水杨醛的前体是食物中的酚甙类物质(Pasteels, 1983); 而柳弗叶里甲(Phratora vulgatissima)与高浓度的酚甙负相关(Kelly, 1991)。总之, 在植物与昆虫、动物和微生物关系的研究中, 杨柳酚甙被作为一类重要的防御性物质。

机械伤害对树皮中酚甙的产生有明显的诱导作用, 就更表明了酚甙在植物防御方面所起的作用。1989年Clausen等模拟大杨卷蛾对颤杨叶片的伤害, 撕破叶片边缘, 24 h内可导致叶中柳皮甙和颤杨甙的含量明显升高。他们认为这是节间(internode)所贮存的柳皮甙和颤杨甙转运到叶中的结果。并认为这是植物短期诱导防御现象(short-term induced defense, STID)。

在皮部对树皮进行伤害, 所造成的结果与天牛的刻槽产卵有相似, 可以说是此实验对天牛致伤的模拟。经粗提的酚甙类物质加入人工饲料, 并用此饲料喂养天牛幼虫, 初步结果显示高水平的柳皮甙对天牛幼虫的生长发育是不利的(Fang, 2000), 这也许是天牛在多种杨树的树皮上产卵, 但不同品种天牛孵化率和成虫率不同的重要原因。柳皮甙被初步认定是美洲黑杨中主要的防御性物质。

植物的化学防御有2种类型:组成型的防御和诱导型的防御(钦俊德, 1995)。从本实验的结果看, 酚甙类物质既是组成型的又是防御型的。酚甙只在高含量下对昆虫产生毒害作用(Lindroth, 1990), 正常生长下含有, 致伤条件下增加之大更足以证实酚甙的防御性。Nichols-Orians(1993)等已证实柳皮甙的广义遗传力为0.24。实际上, 这只是组成型含量的遗传规律, 而在很多植物中均报道了伤害对次生物质的诱导作用。如烟草Nicotiana中的生物碱(Baldwin, 1988)、防风Pastinaca中的呋喃香豆素(furanocoumarin)。在对欧洲防风(Pastinaca sativa)的研究中, Zangerl和Berenbaum(1990)发现两群体叶片中组成型与诱导型的呋喃香豆素水平的遗传力差异很大。

3.3 植物的防御是有代价的

一般认为, 植物的防御是以牺牲生长为代价的。从本实验结果看, 总酚甙与树高r =-0.304, 另一主要酚甙柳皮甙与生长量r =-0.227, 均达显著水平。也就是说次生代谢产物与生长量的确呈一定的负相关, 但相关系数不是很大。这一结论同时也可回答另一个问题:能否从群体中选择出生长量大而且次生代谢物含量又高的个体呢?回答是肯定的。比如此回交群体中的40、405、415、440、495、533、551等无性系其柳皮酚含量≥2.0;高生长量≥2.8。可见在此群体中的选择是有效的。