板栗(Castanea mollissima Bl.)空苞现象是制约我国板栗单产提高的主要因素之一。对板栗的显微观察发现空苞主要发生在幼胚发育期, 合子(受精卵)发育所需的有机营养物质未能从胚乳细胞中得到, 阻碍了合子发育(杜国华等, 1995)。袁艺等(1997)的营养物质含量分析进一步证实了合子形成后的营养供应不足是造成空苞栗子房发育停滞的原因。实际上, 果树座果受子房内源激素含量及平衡的调控(Ram, 1983; Yuan et al., 1988), 研究者也推测板栗子房中低含量的生长促进物质和高含量的抑制物质可能造成了合子分裂停滞(杜国华等, 1994; 1995)。本研究拟通过空苞栗胚胎发育期子房内源激素和主要营养物质含量分析, 探讨板栗子房内源激素含量与营养物质积累的关系, 为板栗空苞的控制提供理论依据。

试验在湖北省京山县虎爪山林场进行。试验点位于京山县虎爪山南坡中下部, 坡度10°, 土壤是以灰色薄层泥质灰岩、燧石结核灰岩、硅质岩、石英岩状砂岩为主发育的黄棕壤。在多年无人管理的板栗杂木林内选5株15 a生的青毛早栗空苞树(空苞率68%以上), 并以附近板栗生产园正常结果(空苞率16.7%以下)的5株12 a生青毛早为对照。1996~1997年对空苞树和正常结果树于葇荑花序基部雌花簇刚出现时对各雌花簇挂牌标记, 以雌花柱头出现且反卷前为花后第0天, 记为0DAB (days after blooming), 并根据本地区正常结实板栗的胚胎发育过程(姚家琳等, 1989), 于花后第5 d至105 d (5 DAB至105 DAB)每10 d 1次, 分别对雌花簇或总苞采样30枚以上。由于25 DAB时起, 空苞栗坚果明显比正常栗小, 因而从25 DAB起, 空苞栗样品中剔除坚果生长正常的少数样品, 正常栗样品则剔除坚果明显较小的少数样品。各取子房(后期含胚) 50 g FW以上, 所有样品置冰瓶中迅速带回, 其中约5 g FW子房液N固定, 迅速称取0.3~0.5 g FW样品9份, 编号登记后, 置-40℃下保存待测内源激素含量。其余子房(含胚)以自来水及蒸馏水冲洗后, 去离子水冲洗、凉干, 置105℃下杀青15 min, 70℃下烘至恒重(除蛋白质、氨基酸样品外), 不锈钢磨粉碎过60目筛干燥保存, 待测营养物质含量。

内源激素含量分析  样品分别置于预冷的3 mL 80%甲醇的小瓶中, 加入1 nmol·L^-1 BHT (丁基化羟基甲苯)和1 nmol·L^-1PVP (聚乙烯吡咯烷酮), -40℃下浸提60 d以上(周志翔, 1999)。各取300 μL浸提液采用ELISA法(吴颂如等, 1988)定量测定所有样品中的GA₁₊₃、iPA_S和ABA含量。其中激素酶联免疫检测试剂盒及酶标板由南京农业大学提供, 检测读数使用DG3022A型酶联免疫检测仪(南京华东电子管厂制造), 检测波长490 nm。

营养物质含量分析(南京农业大学, 1988) :还原糖(3, 5-二硝基水杨酸比色法), 可溶性淀粉(简称淀粉, 蒽酮比色法), 可溶性蛋白质(简称蛋白质, 考马斯亮兰G-250法)、游离氨基酸总量(简称氨基酸, 茚三酮比色法)、N (碱解N, 凯氏定氮法)、P (H₂SO₄-H₂O₂消煮, 钒钼黄比色法), K (H₂SO₄-H₂O₂消煮, 火焰光度计法), B (姜黄素比色法)。

正常栗和空苞栗子房内源GA₁₊₃、iPA_S, ABA含量及其比值在胚胎发育的不同时期[花后第5 d (5 DAB) ~花后第105 d (105 DAB) ]均有较大的差异(表 1)。板栗授粉早期(5 DAB)正常栗与空苞栗的内源激素含量及其平衡没有差异。伴随着授精过程和合子原胚的发育(姚家琳等, 1989), 正常栗子房内源GA₁₊₃、iPA_S含量和(GA₁₊₃+iPA_S) /ABA值分别在花后25 d (6月中旬)和花后75 d (8月上旬)出现2次峰值, 授精期(5月下旬)、花后45 d (7月上旬)和果实成熟期(9月上旬)为低谷; 而子房内源ABA含量变化趋势与前者相反, 且幅度较小。空苞栗子房相应的内源激素含量及其比值在授粉后即开始表现出与正常栗的差异, 在整个胚胎发育期未出现明显的峰值, 且子房内源GA₁₊₃、iPA_S含量和(GA₁₊₃+iPA_S) /ABA值呈下降趋势, ABA含量呈上升趋势。

表 1 板栗胚胎发育期子房内源激素含量^① Tab.1 Contents of endogenous hormones in ovary during embryonic period

表 1 板栗胚胎发育期子房内源激素含量① Tab.1 Contents of endogenous hormones in ovary during embryonic period

板栗胚胎发育期(5 DAB~105 DAB)子房营养物质含量测定发现(表 2), 空苞栗子房的还原糖、淀粉含量在花后45 d合子原胚形成之前与正常栗间无明显差异, 且蛋白质和氨基酸含量以空苞栗子房较高, 这可能与空苞栗坚果生长及胚珠胚囊发育缓慢消耗减少有关。而合子原胚形成后(45 DAB后)空苞栗子房有机营养的持续降低, 可能与胚的发育停滞相关。正常栗子房还原糖含量在幼胚形成期(45 DAB~75 DAB)的高水平, 以及淀粉、蛋白质、氨基酸含量在幼胚形成期的迅速增加, 有利于胚的发育及果实生长, 可能在此期间子房内源GA₁₊₃, iPA_S含量及(GA₁₊₃+iPA_s) /ABA值的水平有关(表 1); 而空苞栗子房在幼胚形成期的有机营养物质含量均比正常栗低, 虽然空苞栗子房的还原糖含量在45 DAB前开始增加, 淀粉含量也在胚形成后开始有所积累, 但终因胚的发育停滞或营养供应受阻而逐步下降。因此, 空苞栗子房还原糖、淀粉、蛋白质和氨基酸等有机营养在幼胚形成期(45 DAB~75 DAB)均未出现象正常栗一样明显的急剧上升, 反映了此时期空苞栗子房有机营养物质供应或调入的严重不足。

表 2 板栗胚胎发育期子房主要营养物质的含量 Tab.2 Contents of main nutrients in ovary during embryo development period

表 2 板栗胚胎发育期子房主要营养物质的含量 Tab.2 Contents of main nutrients in ovary during embryo development period

从所测主要无机元素的含量及变化差异看, 正常栗的4种主要无机元素含量在授粉后均出现1次下降过程(表 2), 且N、P含量在受精期仍持续下降, 可能与此期的果实迅速生长有关, 而在胚胎发育后期(合子形成之后) 4种无机元素含量基本稳定在较高水平。空苞栗子房的4种无机元素含量在整个胚胎发育期基本都处于持续下降状态, 且P、B元素含量在授粉早期(5 DAB)即明显比正常栗低, K、P在45 DAB~65 DAB期间(幼胚形成期)也未出现象正常栗一样的上升过程, 与正常栗子房中K、P含量差异较大, 可能影响着幼胚的正常发育。

空苞栗显微观察已表明, 板栗幼胚发育期(7月上、中旬)的营养缺乏会导致幼胚发育停滞(杜国华等, 1994; 1995), 而空苞栗幼胚发育期子房中还原糖、淀粉、蛋白质、氨基酸、P和K含量及变化趋势与正常栗间的差异最为明显(表 2)。因此认为, 板栗子房发育停滞形成空苞主要是由于子房中还原糖、淀粉、蛋白质、氨基酸、P和K等营养物质的严重缺乏。正常栗子房还原糖、淀粉、蛋白质、氨基酸、P和K等营养物质在幼胚发育期的高水平或上升趋势与其子房中内源GA₁₊₃、iPA_S含量和(GA₁₊₃+iPA_S) /ABA值的上升趋势一致, 也与ABA含量的下降趋势一致(表 1, 表 2)。可见, 导致子房还原糖、淀粉、蛋白质、P和K等营养物质在幼胚发育期严重缺乏的原因在于子房GA₁₊₃、iPA_S含量及(GA₁₊₃+iPA_S) /ABA值的低水平和ABA含量的高水平。

因此, 板栗幼胚发育期生长类激素(GA₁₊₃、iPA_S)含量降低而ABA含量升高, 致使子房中还原糖、淀粉、蛋白质的积累下降, P、K素吸收减少, 导致营养严重缺乏, 幼胚发育受阻, 使部分子房发育出现停滞现象, 形成空苞。当然, 此时生长类激素含量降低和ABA升高的原因尚不明确。既然合子已形成, 可以肯定与受精作用无关, 可能在生长类激素降至低谷后存在某种启动因子, 使正常栗生长类激素再次上升, 且树体营养也充足, 幼胚正常发育; 而未启动时GA₁₊₃、iPA_S仍处于低水平, 树体营养亏缺, 造成子房营养缺乏和发育停滞, 产生空苞。