花色素苷和其它黄酮类色素是植物中一大类次生代谢产物, 它们可以使植物的花、叶、果、茎产生丰富的色彩, 另外还在昆虫传粉、生长素运输、保护叶片免受紫外线伤害、抑制病虫害和根瘤诱导等方面有很重要的作用(Forkmann, 1991)。花色素苷存在于细胞液泡中, 以糖苷的形式存在, 具有吸光性而表现出粉色、紫色、红色及蓝色等。对于这些色素的生物合成与代谢途径, 生物化学家已进行了较为细致的研究(Chen et al., 1981; Griesbach, 1983)。

1 花色素苷及其生物合成 1.1 花色素概述

花色素一词最早由Marquart (1835)提出, 用来描述花卉中一种水溶性的色素。15 a后, Morot (1849)成功地分析出矢车菊的蓝色色素是由C、H、O 3种元素组成的(Jayaram et al., 1990)。对这类色素详细的化学分析始于19世纪末和20世纪初, 有许多相关报道(East et al., 1911; Wheldale, 1911)。Wheldale (1911)首次描述金鱼草(Anthirrhinum)花色素分子的基因特征。到20世纪30年代就已证明, 所有的类黄酮都是由一个C6-C3-C6的基本骨架组成的, 即两个芳香环和一个含氧杂环, 并根据中间吡喃环的氧化程度不同, 可将类黄酮分为12类, 即查尔酮(chalcones)、橙酮(aurones)、黄酮(flavones)、黄酮醇(flavonols)、黄烷酮(flavanones)、二氢查尔酮(dihydrochalcones)、儿茶精类(catechins)、黄烷-3-4-醇(flavan-3-4-dilos)、双类黄酮(biflavonoids)、异构类黄酮(isoflavonoids)、原花色素(proanthcyanidins)和花色素苷(anthcyanins) (Madhuri, 1999)。

自然界广泛分布的花色素以天竺葵色素(pelargonidin)、矢车菊色素(cyanidin)及翠雀素(delphinidin)为主, 由此再衍生出其它3种花色素, 如芍药花色素(peonidin)是由矢车菊素甲基化形成的; 矮牵牛花色素(petunidin)及锦葵色素(mavlvidin)则由翠雀素不同程度的甲基化而来的(Martin et al., 1993; Kondo et al., 1992)。天竺葵色素呈现砖红色; 矢车菊素及芍药花色素表现为紫红色; 而翠雀素、矮牵牛色素及锦葵色素表现蓝紫色系(Mazza et al., 1993; Strack et al., 1989)。由于花色素的吡喃环上的氧是4价的, 具有碱性特征, 而本身的酚羟基又呈现酸性, 所以酸、碱都可以与它作用形成盐。花色素的结构如图 1所示。

1.2 花色素苷的生物合成

对于花色素苷的生物合成途径的研究已十分详尽, 有很多文献报道(Forkmann, 1991; Jayaram, 1999)。其中3种植物在研究合成途径和基因分离中起至关重要的作用, 即玉米(Zay mays), 金鱼草和矮牵牛(Petunia)。

花色素苷的生物合成前体是丙二酸单酰CoA和对香豆酰CoA (p-coumaroyl-CoA), 二者在查尔酮合成酶(chalcone synsathase, CHS)的催化下形成黄色的查尔酮(chalcone); 它可以自发缓慢地异构化, 形成无色的黄烷酮(flavanone), 也可以在查尔酮-黄烷酮异构酶(chalcone-flavanone isomerase, CHI)的催化下加速完成; 在黄烷酮羟基化酶(flavanone-3-hydroxylase, F3H)的催化下, 形成香橙素(dihydrokaemferol, DHK), 还可以在F3′H的催化下形成双氢槲皮素(dihydroquercetin, DHQ), 或在F3′5′H的催化下形成双氢杨梅树皮素(dihydromyricetin, DHM)。这些无色的双氢黄酮醇(dihydroflavonol)在双氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol 4-reductase, DFR)的催化下会进一步还原成无色花色素(leucoanthocyanidin); 它经过1~2步的转化形成有色花色素(anthocyanidin), 然后糖基化形成花色素苷(anthocyanin), 这步是由UDP-葡糖类黄酮-3-氧-葡糖基转移酶(UDP glucose flavonoid 3-oxy-glucosyl transferase, UF3GT)完成的(Czygan, 1980; Hugo et al., 1991; Holton et al., 1995)。

2 影响花色素苷表现的因素 2.1 花色素苷的结构

以花色素苷为主要色素的花色从橙色到红、紫、蓝、黑色, 显现出十分广泛的色系, 这在很大程度上是由于花色素苷化学结构上的微小差别, 或者化学结构虽然相同, 但由于溶液的物理或化学条件不同也会产生色调的变化。

花色素苷所带的羟基数、羟基甲基化的程度、糖基化的数目、种类与连接位置及与糖基相连的脂肪酸或芳香族酸的种类和数目等因素, 都会影响到花色的表达(表 1) (Mazza et al., 1993)。

2.2 细胞pH值对花色的影响

在植物液泡中, 花色素苷以阳离子的形式存在。早在20世纪初Willstatter就提出了蓝色花的细胞液呈碱性, 红色花的呈酸性的假说, 但这一假说很快被驳斥。Shibata等在1919年提出不论哪种颜色的花、果或叶片其pH值均在2.8~6.2之间, 即都是弱酸性或中性(Jurd et al., 1966; Kondo et al., 1992; Yoshida et al., 1995)。但到了70年代, Stewart等(1975)通过微量比色法测定了250多种花瓣细胞液的pH值, 发现其范围在2.5~7.5之间, 而且红色花的表皮细胞较蓝色花酸, 同时红色花瓣衰老时常伴有颜色转蓝和液泡pH值增加, 所以他们认为pH值的改变是影响花色的因素之一。Chuck (1993)报道了从矮牵牛中分离得到的一个能调控pH值的基因pH6。如果通过反义RNA技术使月季花中的pH6基因失活, 从而使pH值提高, 将为培育蓝色月季带来新的希望。在报春花中, 基因R控制pH从5.4~6.2的转变(Forkmann, 1991)。月季许多品种的花瓣外表皮细胞的pH值为3.56~5.36, 呈现紫色或淡蓝色的月季pH值偏高(Mol et al., 1999)。

Asen (1969;1975)和Mazza (1990)研究了在体外(in vitro)的花色素苷的颜色受pH值的影响, 当pH < 2时, 花色素苷主要以带正电的花[flavylium cation (AH⁺) ]形式存在, 呈红色(C-3-O-sugar)或黄色(C-3-H); 当pH值提高(pH < 3)时, 带正电的花容易在C-5、C-7和C-4′的任何位置上的羟基失去1个H⁺质子而变成不稳定的红色或蓝色的醌型醛碱(A); 若醌型醛碱在C-5、C-7和C-4′位置上的羟基同时失去2个H⁺, 在pH > 6时, 容易转换成离子化的醌型醛碱(A⁺), 产生大量的高吸光效应及吸收波长的迁移而形成多样的花色; 在pH值为3~6时, 大部分带正电的花会在C-2位置发生水合反应形成无色的甲醇假碱(carbinol pseudobase), 并同时伴有C-O键裂解和H⁺转移(Brouillard et al., 1977; 1978;Cheminat et al., 1986)。甲醇假碱可进一步裂环反应(ring-open)和异构化, 形成无色的顺式查尔酮[cis-chalcone (CE) ]和反式查尔酮[trans-chalcone (CZ) ], 它们的羰基是靠近B环的。若带正电的花C-3位置没有糖基化, 则这种结构的转换仅限于pH在4~5范围内发生。在水溶液中, 这4种不同花色素型式会达到平衡, 其相对含量随pH值和花色素苷结构而改变, 而颜色则由pH值决定(Chen et al., 1981; Strack et al., 1989)。

2.3 共色作用

共色作用是指类黄酮及其它有关化合物(称为共色素, copigment)与花色素苷结合在一起而呈现增色效应(hyperchromic effect)及红移(bathochromic shift), 产生从紫色到蓝色的色系(Asen et al., 1970; 1971;Mazza et al., 1993)。这种现象最早由Robinson G.M.和Robinson R.观察到, 并在鸭跖草苷(commelinin)等结构分析中得到证实(Jurd et al., 1966; Kondo et al., 1992)。

共色素本身对于花色并无直接的影响, 而是影响带正电的花与无色的甲醇假碱的水合反应的程度以稳定及加强花色素苷的成色。可以成为共色素的分子有类黄酮、多酚类、生物碱、氨基酸和有机酸等, 花色素本身也是, 其中无色的类黄酮和多酚类是高等植物中最常见的共色素(Hoshino et al., 1981; Mazza et al., 1990; 1993)。共色效应是由多种因素决定。色素成分相同而共色素不同, 花瓣表现的颜色会不同; 但成分相同的共色素, 由于立体结构不同也会产生不同的效果。在固定条件下, 花色素苷的浓度越高其共色作用越明显, 显著程度受共色素与花色素苷的摩尔比影响, 即摩尔比越大共色效应越大。另外, 共色效应也随花色素甲基化和糖基化程度的增加而增加(Asen et al., 1971; Mazza et al., 1990)。

藏报春(Primula praenitens)的基本花色素苷为锦葵-3-葡糖苷, 黄酮醇产生的共色素受基因B控制, 含有共色素(BB)的花色为紫色, 缺少黄酮醇(bb)的花色为紫酱色(Forkmann, 1991)。Holton等(1993)报道了从矮牵牛中克隆并表达的共色素黄酮醇合成酶基因F1, 增加这种共色素通常会使花显蓝色。月季的一种蓝色花品种, 其花色是由于含有绯红色的矢车菊-3, 5-双糖苷和大量的没食子鞣质作为共色素造成的(Brouillard, 1983)。除了分子间的共色, 还发现有分子内的共色。例如将桔梗(Platycodon)、吊竹梅(Zebrina)、千里光属(Senecio)的花色素苷提取后, 发现它们含有不只一个芳族酰基取代基, 这些取代基不仅使花色改变, 还有助于花色素苷提取物的稳定(Harborne, 1988)。

2.4 金属络合物的影响

Shibata等在20世纪初提出了金属络合物的假说, 即某些金属会与花色素苷B环上的O-dihydroxyl基结合形成高度着色而且稳定的金属络合物。金属络合物可以使花色偏蓝。1958年Hayashi等从鸭跖草(Commelina communis L.)中分离出一种含Mg²⁺的蓝色色素结晶体——鸭跖草苷(Kondo et al., 1992)。1992年Kondo等证实鸭跖草苷为一种含Mg²⁺的花色素苷, 其结构是3种成分([M6F6Mg2]^6-)组成的, 其中M为花色素苷, 是一种malonyalwobanin{delphinidin 3-[O-6″-(4-coumaroyl) glucoside]-5-(6″-malonylglucoside) }, B环通常以4′-酮基-醌型醛-3′氧离子(4′-ketoquinonidal-3′oxyanion)型式存在, F是一种共色素, 7-甲基异牡荆葡氧基黄酮4′-糖苷[flavocommelin (7-methylisovitexin 4′-glucoside) ], Mg²⁺是一种金属离子, 可为Mn²⁺、Cd²⁺、Zn²⁺、Co²⁺和Ni²⁺所取代(Kondo et al., 1992)。

矢车菊(Centaurea cyanus)的蓝色花是由于矢车菊-3-(6′-琥珀糖苷) -5-葡糖苷与铁离子络合, 并以黄酮醇为共色素形成的(Takeda et al., 1983)。绣球花(Hydrangea)的花瓣从红色变为蓝色是因为铝离子与翠雀-3-葡糖苷结合, 以3-氯原酸为共色素形成的(Takeda et al., 1985)。

2.5 花瓣细胞形状的影响

我们实际看到的花色并不是细胞内色素的直接反应, 花瓣色素被具有各种结构的组织所包围, 从而改变了入射光线。一般认为圆锥形可以增加入射光进入表皮细胞的比例, 入射光碰到有角度的圆锥形细胞会发射进入表皮细胞, 若碰到没有角度的扁平细胞则完全反射回去。所以, 具有圆锥形突起的花瓣细胞可以吸收较多的光线, 而使色泽变深。如花菖蒲的紫色不仅与花色素的含量有关, 还受外花被表皮细胞的长度和排列顺序的影响(Yabuya, 1993)。Noda等通过扫描电镜和组织解剖的研究发现, 深色金鱼草的花冠裂片表皮细胞呈圆锥突起, 而浅色的变种则呈扁平状。通过利用Myb基因相关的转录因子控制细胞的形状, 可以改变金鱼草着色的浓度(Noda et al., 1994)。

3 花色的基因工程 3.1 花色素苷的基因克隆

影响花色素苷代谢的基因分为结构基因和调节基因。结构基因直接编码花色素苷代谢的生物合成酶, 调节基因控制结构基因表达的强度和方式。第1个被分离的花色素苷合成酶基因是CHS基因, 它是从欧芹(Petrosklinum hortense)悬浮培养细胞再经差异杂交得到的(Kreuzaler et al., 1983)。以后利用转座子标签、PCR扩增、差异杂交、cDNA克隆等方法和手段, 分别在玉米、矮牵牛、金鱼草等材料中克隆出了多个与花色素苷生物合成过程相关的结构基因(Oreilly et al., 1983; Martin et al., 1991; Britsh et al., 1992; Weiss et al., 1993)。调节基因克隆主要是采用转座子标签技术。金鱼草中的3个调控基因delila, eluta和rosea主要对花色素苷合成后期起调节作用(Almeida et al., 1989; Martin et al., 1991), 矮牵牛4个位点的an1, an2, an10和an11基因对UF3GT酶的活性和DFR, mRNA表达量均有类似的调控效应(Beld et al., 1989)。目前已分离出2类色素调控基因:一类为myc型转录因子, 如玉米中的R基因家族和金鱼草的delila基因(Goodrich et al., 1992); 另一类是myb型转录因子, 如玉米中的C1、P1和P基因(Dooner et al., 1979)。Goff等(Goff et al., 1991)认为这两类转录因子相互激活结构基因的转录。

3.2 修饰花色的浓淡

利用基因工程修饰或改变花色的方法主要有2种:一是控制自身花色素苷合成途径中的某些基因, 使合成停留在某个步骤, 从而使花色变淡; 二是通过导入全新的外源基因来创新花色。

通过抑制类黄酮合成途径中的某些基因表达来修饰花色, 已经在许多植物中得以实现, 如矮牵牛、菊花(Chrysanthemum)、非洲菊(Gerbera)、月季(Rosa)等。主要是运用反义技术将一段基因反向插入植物体内, 使之与内源互补的mRNA结合, 抑制蛋白质的合成而使花色改变。但正向导入一个或几个内源基因的额外拷贝却不能使该基因增强表达, 相反却抑制了基因表达, 即共抑制现象(co-suppression)。

矮牵牛是第1例被运用基因手段来修饰花色浓淡的(Vander et al., 1988)。反义的chsA基因改变了矮牵牛和烟草的花色, 转化株出现了具有各种深浅花斑和开白花的品种。矮牵牛的查尔酮合成酶基因家族有12个成员, 其中只有2个在花中表达(Koes et al., 1989), 而在开白花的植株中均未发现这2个基因。进一步的研究还发现, 这些转化株的花色受激素和光照的影响, 对它们喷施赤霉素(GA)可使花斑有色区颜色加深, 喷施B₉ (它可抑制内源GA形成)会使花色变淡; 对它们进行补光处理会使花色变为全白色。Krol (1990)将dfr基因cDNA与TMV35S启动子及nos3′片段连接, 转化到矮牵牛细胞中并再生植株, 得到的6个转化体的花色均不同程度地变淡。经测定颜色变淡的花瓣中dfr基因mRNA含量下降。事实证明, 只要转化的基因与已有的基因存在顺序上的同源性, 则二者的表达均会受到抑制。美国一家DNA技术公司研究了共抑制作用得到转化体性状的稳定性(苏焕然等, 1996)。通过抑制chs的表达而改变了菊花、月季和矮牵牛的花色, 对这3个开白花的转化株系的长期观察和繁殖发现, 这种表型很稳定, 未发生回复突变, 可以投放市场。将chs导入深红色的月季品种后, 花色变为淡红或洋红色, 但没有出现开白色花的个体(Zuker, 1998)。

另一类改变花色浓淡的方法是导入调节基因, 使特定的结构基因得以表达, 从而改变花色。例如将花色素苷激活剂R和C1导入拟南芥和烟草后, 其白色的花冠均不同程度地变粉。Quattrocchio等将一系列的花色素苷代谢的调节基因转入矮牵牛后, 得到了红色的愈伤组织和粉红色的花冠。包满珠等将C1和Lc基因转入矮牵牛, 得到部分转化株的花冠由白色变为粉色(傅荣昭等, 1993)。

3.3 创新花色

运用反义技术或共抑制技术可以改变花色的浓淡, 但为了创造出观赏植物本身不具备的花色, 就要通过导入新的外源基因来实现了。

Meyer等(1987)首次运用从玉米中得到的基因转入矮牵牛使其改变了花色。矮牵牛自身不能产生天竺葵色素, 因为其DFR对底物的专一性, 即不能还原香橙素, 只能以二氢杨梅树皮素和二氢槲皮素为底物, 合成无色的花色素苷。将编码玉米DFR的A1基因转入矮牵牛RL01突变体(花色为近白色, 因缺少类黄酮3′羟化酶和3′5′羟化酶而有大量的香橙素的积累), 以CaMV35S为启动子, 使矮牵牛体内产生了一条合成砖红色天竺葵色素的新途径。Benfey等(1990)还用EPSPS为启动子与A1基因连接, 转入矮牵牛RL01和W80突变体(花色为纯白色), 结果RL01系转化株呈现桔粉色, 而W80系转化株呈现出浅粉色。Helariutta (1993)将非洲菊中分离出的gdfr基因转入矮牵牛的RL01中, 并以玉米的A1基因为对照, 结果发现gdfr转化株呈现出的砖红色较A1转化株的颜色深, 进一步的观察还发现A1转化株在夏季的花色会变淡, 甚至变为白色, 而gdfr转化株的稳定性很强。

菊花产生的主要花色素苷是矢车菊3-丙二酰糖苷, 而没有天竺葵色素, 可以通过抑制f3′h基因的表达使其产生天竺葵色素, 创造出新颖的红色花。在康乃馨花中, I基因调控CHI的活性, 隐性的ii基因型个体可以产生黄色花, 其主要色素是异杞柳查尔酮苷(isosalipurposide), 一种2′-糖苷的查尔酮, 同时它也是黄牡丹(Paeonia trolloides)、垣河十万错(Asystasia gangetica)和口红花(Aeschynanthus parvifolius)的主要色素(Forkmann, 1980)。

创造和培育蓝色花一直是园艺学家梦寐以求的。运用分子手段创造蓝色花必须满足3个条件: (1)能够合成3′, 5′-羟基化花色素苷(翠雀素); (2)有黄酮醇作为共色素; (3)相对较高的液泡pH值(pH > 5.0)。另外对花色素苷的修饰(如酰化、甲基化、糖基化等)也可使花色偏蓝。3′, 5′-羟基氧化酶是编码合成蓝色翠雀素的关键酶, 但在一些重要的观赏植物中创造翠雀素并不是一件容易的事, 待转化的植物需要有F3′5′H底物香橙素或二氢槲皮素, 还要有可以将二氢杨梅树皮素转化为翠雀苷的酶, 并在液泡中积累(Yoshlda et al., 1995)。对月季色素的研究较深入, Yokoi (1974)分析了月季的8个种670个品种, 发现只有矢车菊-3-糖苷和3, 5-双糖苷、天竺葵-3-糖苷和3′, 5-双糖苷、芍药素-3, 5-双糖苷, 而没有翠雀素(Mol et al., 1989)。所以用传统的育种方法是不能培育出真正的蓝色月季的。目前大多数称之为“蓝色”的月季, 实际上只是淡蓝色或紫色, 色素是矢车菊-3, 5-双糖苷, 并含有大量的黄酮醇。澳大利亚的Caigene Pacific公司与日本的三得利公司合作向月季导入合成蓝色色素的基因(3′, 5′-羟基氧化酶), 获得了成功。在康乃馨和菊花中也缺少这种基因, 通过转基因可以扩展花色的范围(苏焕然等, 1996)。

4 结论

传统的花色育种费时费力, 而且有很大的局限, 一是基因库的限制, 没有一个天然植物种群具有表现全部色谱的基因; 二是不能有效地控制育种过程, 即不能保证在改变花色的同时不改变其它的观赏和生长特性。近年来飞速发展的分子生物技术已经打破了种的限制, 花卉的分子育种时代已经到来。从一种植物中获得的基因可以经过适当的载体克隆并转移到其它植物中, 并得以表达和遗传。这一技术可以有效地对植物的性状加以改良和修饰, 从而使育种更具有方向性。通过调控花色素苷生物代谢的模式和基因的表达, 以及对转基因技术和对影响花色的相关因子的研究, 可以为创新花色提供广阔的前景和全新的思路。