苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, 简称Bt)是一类在自然界中广泛分布的革兰氏阳性细菌, 其主要特征是在孢子形成的同时产生伴孢晶体, 又称杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, ICPs)或δ-内毒素, 由于这类蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目昆虫及动植物寄生线虫等有较强毒杀作用, 而对人和家畜无毒、不污染环境, 因而在全球农、林、卫生害虫防治中得到广泛应用。1996年Guo和Chak将PCR和RFLP两种技术结合而产生了PCR-RFLP (又称CAPs)新技术, 并应用于进行Bt cry1类基因的鉴定; 1997年宋福平等在国内先后建立了cry2~cry11等Bt常见基因类型的CAPs鉴定体系, 该体系能鉴定150余种的cry基因。目前这种技术已经被国内外许多学者用于Bt菌株cry基因鉴定和杀虫活性预测。本文应用PCR-RFLP技术, 对我国不同森林立地带土壤中分离的72株Bt野生菌株cry基因进行了分析, 同时研究了各基因编码的晶体蛋白表达, 并对棉铃虫幼虫进行了杀虫活性测定。

1 材料和方法 1.1 菌株及来源

72株Bt菌株为中国林科院森林保护研究所从我国不同森林立地带土壤中分离的。

1.2 DNA样品制备

取供试菌株接种到LB液体培养基中, 30℃、220 r·min^-1培养12 h, 取500 μL菌液离心、去上清, 悬浮于200 μL超纯水中, 煮沸8 min, 冷却后离心取上清作为PCR模板。

1.3 PCR-RFLP分析

分别用K5un2/K3un2和K5un3/K3un3 (Kuo et al., 1996)、S5un2/S3un2、S5un3/S3un3、S5un4/S3un4 (宋福平等, 1998)、5un5/S3un5、S5un8/S3un8、S5un9/S3un9、S5un11/S3un11和S5uni/S3uni (待发表资料)共10对引物鉴定Bt菌株的cry1、cry2、cry3、cry4、cry5、cry8、cry9、cry10、cry11和cry1Ⅰ等10类基因, 方法参见文献宋福平等(1998)。

1.4 杀虫晶体蛋白SDS-PAGE分析

将Bt接种于牛肉膏蛋白胨培养基于30℃、220 r·min^-1培养40 h, 取100 μL菌悬液离心, 菌体悬浮于100 μL无菌水中, 加入25 μL 0.5mol NaOH混匀, 室温裂解5 min, 加入65 μL 3×样品缓冲液混匀, 煮沸10 min, 14000 r·min^-1离心5 min, 取上清进行SDS-PAGE电泳分析, 方法见文献萨姆布鲁克等(1992)。

1.5 生物活性测定

试虫:棉铃虫(Helicoverpa armigera)初孵幼虫。方法:参见文献郭予元(1998)。

2 结果与分析 2.1 Bt菌株cry基因型鉴定

采用已建立的PCR-RFLP方法, 对72株Bt菌株进行了杀虫晶体蛋白cry基因型鉴定, 结果列入表 1, 其中只列入了41株有蛋白表达和杀虫基因菌株的鉴定结果。结果表明, 同时含有cry1, cry2, cry1Ⅰ 3类基因的有21株菌, 共同含有cry1, cry2类基因的6株, 含有cry1和cry1I的4株, 只含有cry1基因的1株, cry2类基因的4株, 36株菌不含所鉴定的10类cry基因; 72株菌中均不含cry3、cry4、cry5、cry8、cry9、cry10、cry11基因; 图 1为部分菌株的cry1类基因鉴定的PCR-RFLP图谱。

2.2 杀虫晶体蛋白SDS-PAGE分析

通过SDS-PAGE方法, 测定了72株菌所表达的ICPs分子量, 结果见表 1, 有28株菌表达约130 kDa的蛋白; 32株菌表达约60 kDa的蛋白; 有3株菌表达约90 kDa的蛋白(26、27与29号菌株), 两株表达140 kDa的蛋白(5与18号菌株)。图 2为部分菌株蛋白的SDS-PAGE图谱。

苏云金芽孢杆菌cry1基因表达的杀虫晶体蛋白的分子量大部分在130~140 kDa之间, 而cry2蛋白在60 kDa左右。通过对各个菌株的SDS-PAGE分析和基因鉴定结果比较发现, 蛋白的表达与相应基因的存在有一定的对应关系, 表达130 kDa蛋白的菌株经鉴定都含有cry1基因, 而表达60 kDa蛋白的菌株绝大多数有cry2基因, 但也有个别菌株例外, 如7号菌株虽表达了60 kDa的蛋白, 而没有鉴定出含cry2的基因。而表达140 kDa和90 kDa蛋白的几株Bt, 经鉴定它们均不含上述10种基因, 推测这些菌株可能含有其它类型的cry基因。

2.3 苏云金芽孢杆菌对棉铃虫毒杀活性测定

取72株Bt菌株培养液10 mL离心, 去上清, 用100 mL的无菌水悬浮, 以此浓度的悬液处理初孵棉铃虫幼虫, 表 2为部分菌株的杀虫结果。经调查发现同时表达130 kDa和60 kDa蛋白的菌株对棉铃虫具有较高毒力, 不仅表现在致死率方面, 在抑制棉铃虫生长方面表现也比较明显, 试虫生长缓慢, 个体小, 部分菌株对棉铃虫体重的抑制率达到90%以上。

3 讨论

综合基因鉴定和蛋白分析结果表明, 除少数菌株外, 绝大多数Bt菌株中杀虫晶体蛋白的表达与相应基因的存在有着对应的关系, 但同时也存在个别的现象(如23和24号菌株鉴定含cry1基因, 但未发现130 kDa蛋白的表达), 原因可能是菌株中有基因存在, 但这些基因可能不表达; 或者蛋白表达存在时间上的差异, 虽有基因存在, 如果在某一特定时间取样就有可能检测不到相应蛋白的表达。cry2类蛋白实际的分子量为70 kDa, 由于细胞产生蛋白水解酶, 杀虫晶体蛋白在制样过程中往往产生不同程度的酶解, 因此SDS-PAGE检测的cry2要略小于实际分子量, 在60 kDa左右。

通过生物测定发现共同含有cry1Aa、cry1Ac和cry2A的菌株对棉铃虫的毒力较高, 而含单一基因的菌株毒力较低。不含cry1和cry2基因的菌株对棉铃虫的毒力都较低或没有毒力。

基因鉴定结果显示有25株菌中含cry1Ⅰ基因, 该基因编码的晶体蛋白分子量大约是81 kDa, 然而SDS-PAGE分析没有发现相应大小的蛋白带, 有报道称该基因通常是沉默的, 在菌株中不表达(Gleave et al., 1993), 因此在本研究中检测不到该基因的表达产物与这种报道相符。

从本文对72株Bt菌的cry基因鉴定、蛋白表达以及杀虫的结果分析, 可以将SDS-PAGE与PCR-RFLP结合起来, 既能检测鉴定基因种类, 又能确定基因的表达与沉默, 同时可以预测菌株的杀虫活性, 这种快速、准确、简便的研究方法, 将极大地推动我国Bt菌株资源的开发和利用。