杨树适应性较强, 易繁殖、生长快, 是速生用材、四旁绿化、水土保持和防风固沙的主要树种, 在生态环境治理中发挥着巨大的作用。但随着杨树栽培面积的不断扩大, 以锈病为主的杨树病害愈来愈严重, 尤其是落叶松—杨栅锈菌(Melampsora larici-populina Kleb.)侵染青杨派、黑杨派及其杂交种的20余种杨树(袁嗣令, 1998), 危害杨树幼苗和幼树生长, 已成为杨树锈病中分布最广, 造成损失最大的一种病害, 严重制约着森林植被的恢复和杨树速生用材林及防护林的发展。

有关杨树叶锈病的大量研究工作主要集中在对病原菌种类及其致病性分化、流行规律、杨树抗锈性的遗传与鉴定、抗病品种选育以及化学防治等方面(田呈明等, 1999; 周仲铭等, 1985), 但对该病的致病机理仍缺乏深入系统的研究。20世纪80年代以后随着电子显微镜技术在多种作物锈菌研究上的成功应用(康振生, 1996), 有关栅锈菌与杨树互作中的超微结构研究也逐渐开展起来, Spiers和Hopcroft (1985)简单描述了自然感病杨树上M. larici-populina和M. medusae的夏孢子发育情况, Werner (1981)介绍了栅锈菌夏孢子侵染杨树的过程及其组织变化。此后, Shain(1984;1987)和Spiers (1990)等分别对M. larici-populina和M. medusae侵染杨树抗病和感病无性系的超微结构进行了观察。同时, Laurans和Pilate (1999)首次对落叶松—杨栅锈菌(M. larici-populina)的E1、E2小种接种一个简单杨树无性系后的组织病理学变化进行了描述, 但缺乏对不同抗性组合中寄主与病原物互作反应的细胞学的系统研究。然而, 我国除对胶锈菌的锈孢子在梨树、海棠等果树上的发育过程的初步观察以外(黄丽丽等, 1994; 周世国, 1992), 对林木锈病菌侵染过程的细胞学与超微结构等方面的研究仍是空白。为此, 本文采用生物电镜技术从细胞学角度研究杨树对锈菌的抗性反应机制以及在抗病性表达过程中, 寄主细胞与锈菌所发生的一系列事件。为进一步系统研究该菌的遗传变异、系统发育学、分类学和抗病育种工作提供科学依据。

供试菌株为落叶松—杨栅锈菌(M. larici-populina Kleb.)夏孢子的4个单孢子菌系:BT (陕西太白)、XN (青海西宁)、TS (陕西眉县)和SB (陕西宝鸡)。菌株分离及繁殖均按常规方法进行(李振岐等, 1989)。

研究用杨树无性系为青杨(Populus cathayana)、44-114杨(P. deltoides × P. trichocarpa)、欧美杨(Populus × euramericana)和太白杨(P. purdomi)、美洲黑杨(P. deltoides)等。不同杨树品种对各菌株的反应型见表 1, 反应型的分级标准用田呈明(1998)的方法。

表 1 不同杨树品种对栅锈菌菌株的反应型^① Tab.1 Reaction type of the isolate on different poplar varieties

表 1 不同杨树品种对栅锈菌菌株的反应型① Tab.1 Reaction type of the isolate on different poplar varieties

将各菌株按涂抹法接种(李振岐等, 1989), 接种时在叶片上喷上一层水膜, 用手指蘸取新鲜夏孢子悬浮液(5×10⁶个夏孢子·mL^-1), 均匀涂抹于叶背, 喷雾并保湿24 h后, 将接种苗放回生长箱中, 在18 ℃~23 ℃下继续培养。

接种后24 h、48 h、花斑出现、花斑明显时各采样一次固定。样品处理按常规方法进行(康振生, 1996), 叶样经戊二醛和锇酸双重固定后, 经系列乙醇脱水, Epon812渗透, 包埋后, 样品切片经醋酸双氧铀—柠檬酸铅双重染色法染色处理后在JEM-100CXⅡ型透射电镜下观察。

栅锈菌的菌丝分布于寄主细胞间隙, 幼龄菌丝的原生质稠密, 核糖体、内质网、线粒体、脂肪粒等细胞器, 液泡较少。老龄菌丝的原生质稠密度减弱, 液泡数量增多体积增大, 但细胞器的形状和分布仍很正常。幼嫩的吸器母细胞隔膜上产生隔膜突, 与吸器母细胞接触部分的寄主细胞壁略有增厚。吸器形成后吸器母细胞中的原生质转入吸器中, 吸器母细胞成为空腔, 内壁有大量深色沉积物, 吸器母细胞内的两个核已完全移入吸器内(图版Ⅰ-1), 此时隔膜突也已脱落。

图版Ⅰ 感病品种和中抗品种的细胞学观察 Plate Ⅰ Cytological observation of susceptible species and middle resistant species Ⅰ-1.感病品种中正常发育的双核吸器, 寄主的细胞核、叶绿体(CH)及原生质聚集在吸器周围(×9820);Ⅰ-2~ 6.中抗品种。Ⅰ-2.中抗品种中可正常产生入侵栓侵入寄主细胞, 形成幼小吸器(H), 吸器外间质(EM)增宽, 侵入钉周围产生胼胝质(箭头处)(×10000);Ⅰ-3.畸形吸器, 外壁染色加深, 寄主原生质解体, 液泡增大(×5800);Ⅰ-4.寄主细胞中的两个吸器的细胞器已有不同程度的解体, 原生质颗粒化, 液泡(V)增多(×7200);Ⅰ-5.已完全坏死的吸器, 寄主原生质解体(×19000);Ⅰ-6.吸器完全被寄主原生质及分泌物包围, 外间质(EM)加宽成为空腔, 吸器质壁分离(×10000)。 Ⅰ-1.A normal haustorium with both nuclei(N), neckband(NB), extrahaustorial matriax and haustorial mother cell(HMC)in the susceptible species and protoplasm gathered around the haustorium(H)(×9820);Ⅰ-2~ 6.In the middle resistant species; Ⅰ-2. The penetration peg could be formed and penetrated into host cell walls, formed small haustorium(H), extrahaustorial matriax(EM)were wider, collar occurs at the penetration site(arrow)(×10000);Ⅰ-3.There are densely stained on the malformed haustral outer layer, protoplasm of host disintegrated and vacuole were bigger(×5800);Ⅰ-4.Organism of two haustoriums in the host cell were disintegrated in different level, protoplasm granulated, vacuole (V) were adder(×7200);Ⅰ-5.Haustoria absolutely died, host protoplasm disintegrated(×19000);Ⅰ-6.The haustoria appears malformed, vacuolated, encapsulated by the host cell secretion and extrahaustoril matrix(EM)widens to be empty(×10000).

吸器颈部的中部形成颈环结构, 染色程度较颈部壁深(图版Ⅰ-1)。颈部周围未见胼胝质, 但集中了大量的管状复合体, 并在吸器颈的内部出现大量球形物质。吸器通常球形或卵球形, 吸器体壁光滑, 内膜与吸器母细胞内膜连为一体, 外质膜连续呈波浪状(图版Ⅰ-1)。吸器体并未与寄主细胞的原生质接触, 而是被外围的吸器外质膜和吸器外间质所隔离, 外间质无任何结构。吸器体中原生质均匀, 细胞器排列形状规则, 均为双核。

栅锈菌在寄主细胞间隙或沿寄主细胞壁延伸时, 寄主细胞保持正常状态。当入侵栓进入寄主细胞后, 寄主细胞膜下陷, 将锈菌的入侵结构包围起来, 并随吸器的不断扩大而逐渐增加表面积。寄主细胞原生质中细胞器与吸器相伴随, 细胞核、线粒体、高尔基体等细胞器大量向吸器周围聚集。

花斑初显时, 病原菌菌丝体在细胞间仍有扩展, 与感病品种相比较, 其菌丝体内出现空泡和球形脂肪粒, 菌体染色加深, 细胞质出现紊乱。与寄主细胞壁接触部分的双核吸器母细胞壁加厚, 吸器母细胞中的细胞器完好, 可正常产生入侵栓侵入寄主细胞, 此时在侵入钉周围产生大量的胼胝质(乳突) (图版Ⅰ-2), 叶绿体、线粒体及大量的管状物聚集在入侵栓周围。侵入成功后, 吸器母细胞中的原生质流入到吸器中, 吸器母细胞空泡化, 内膜上有黑色颗粒状沉积物。幼嫩吸器细胞双核, 吸器周围有大量球形线粒体等寄主细胞器聚集, 吸器中出现较大液泡及管状物, 吸器外间质空间扩大, 质膜染色加深。随着吸器的不断发育, 线粒体等细胞器逐渐移动到吸器边缘, 吸器细胞壁加厚, 液泡大量出现并聚集在吸器中央形成较大空泡。在部分寄主细胞中同时有两个吸器存在, 进而出现畸形坏死。

花斑明显时, 病菌菌丝细胞内出现大量液泡, 细胞质紊乱, 菌丝壁加厚, 菌丝染色加深。吸器母细胞中央的空泡逐渐增大, 细胞核开始解体。

欧美杨接种Bt菌株(“2”型反应)后, 从花斑开始到花斑明显及夏孢子堆产生时, 不断有新的吸器产生, 但吸器受抑现象极为普遍。表现在:①吸器畸形, 染色加深, 形状不规则(图版Ⅰ-3); ②寄主细胞中常见两个吸器, 但均已开始坏死, 原生质逐渐颗粒化, 吸器内壁上沉积大量的颗粒状物质。③吸器内脂肪粒增加, 线粒体肿胀, 空泡增多, 细胞核开始解体(图版Ⅰ-4), 此时在解体吸器细胞核的周围聚集了大量的寄主线粒体(图版Ⅰ-5); ④吸器外间质加宽, 被寄主细胞的原生质及分泌物包围, 空白区域逐渐扩大, 有时出现纤维状或管状物, 最后吸器空泡化(图版Ⅰ-6), 而此时寄主细胞的原生质体中的少数细胞器尚正常, 细胞核正在趋于解体。⑤核膜、线粒体膜、吸器质膜染色加深, 有颗粒状物质沉积; ⑥吸器颈的上部及吸器的一部分或全部被寄主细胞包围, 被包围的吸器最终坏死, 但坏死情况有别; ⑦吸器原生质膜与吸器壁脱离, 细胞核逐渐缩小, 原生质解体后在核膜与吸器壁之间出现较大的空白区, 最后吸器细胞核坏死。

菌丝体在细胞间的扩展情况和中抗品种相似, 但菌丝数量减少、畸形, 染色加深; 菌体内原生质紊乱, 胞内出现脂肪粒及空泡, 线粒体肿胀畸形, 叶绿体聚集在吸器周围。病菌侵入受到寄主强烈的抑制作用, 主要表现在:①在入侵栓侵入寄主细胞时, 吸器母细胞壁以及与吸器母细胞接触的寄主细胞壁同时加厚。②侵入钉周围出现由寄主分泌物形成的乳突状结构(图版Ⅱ-1、2)。③颈环附近的寄主质膜内陷与入侵栓之间有一间隔区, 其中有大量的管状物、液泡及寄主线粒体等; 侵入成功以后在颈环以上部位沉积有大量的胼胝质物质。④幼小吸器外壁部分加厚, 颜色加深; 液泡及脂肪粒增多, 吸器外间质加宽, 内有丝状电子致密物沉积; 随吸器的不断成熟, 吸器内空泡增大, 原生质染色程度加深, 线粒体变为线形排列在吸器边缘, 核膜消失, 原生质聚集在吸器周围并逐渐成为颗粒状, 细胞器解体后分散在原生质中。⑤吸器母细胞空泡化, 质膜脱落; 部分吸器母细胞空泡化, 入侵栓未能正常侵入寄主组织。⑥大量的幼小畸形吸器出现, 边缘不规则, 未能正常扩张膨大, 吸器体壁多处呈棱角状(图版Ⅱ-3); 原生质中液泡增多、增大, 包围吸器的寄主分泌物逐渐颗粒化, 大量的叶绿体、线粒体等细胞器伴随在吸器周围; 吸器开始坏死, 寄主细胞核尚完整, 叶绿体中淀粉粒增多。⑦一个寄主细胞中有2~3吸器, 但多数畸形(图版Ⅱ-4)。

图版Ⅱ 高抗品种中吸器的发育 Plate Ⅱ Haustral development in the resistant species Ⅱ-1 ~ 2.与吸器母细胞接触部位的寄主细胞壁和吸器母细胞壁加厚, 吸器母细胞(HMC)内膜沉积大量深色物质, 侵入钉穿透寄主细胞壁, 寄主细胞分泌大量胼胝质(C)形成乳突状(箭头处)结构包围入侵栓, 吸器内液泡增大(1.×19000, 2.×7200);Ⅱ-3.畸形吸器(H), 体壁多处呈菱角状(×4000);Ⅱ-4.寄主细胞内有多个畸形吸器(H), 叶绿体淀粉粒(SG)增大, 寄主细胞核解体(×3000);Ⅱ-5.未能正常发育的畸形吸器, 颈部胼胝质(C)形成围领结构, 吸器壁及原生质解体(×7200);Ⅱ-6.吸器外间质(EM)加宽, 内含染色程度较浅的颗粒状物, 并沉积在吸器外质膜上, 吸器下部的吸器外质膜断裂, 断裂部分膨大呈蝌蚪形(箭头处), 叶绿体淀粉粒消失(×5000) Ⅱ-1 ~ 2.The wall of haustorium mother cell (HMC) and the host cell wall, which contacted with host cell wall, was thickened, host cell produced collar(C)material fo rmed papillate at the penetration site, and around ahaustorial neck, the haustorium (H)with neckband(NB) and extrahaustorial matrix, but the vacuole (V)was bigger(1.×19000, 2.×7200);Ⅱ-3.Malformed haustoria(H), the walls were abnormal(×4000);Ⅱ-4.There are many malformed haustorias (H), starch grain(SG)of chloroplast become bigger and host cell nucleus disintegrate(×3000);Ⅱ-5.A viable host cellwith chloroplast(CH), haustorial mother cell(HMC), mitochondrion(M) and unable development malformed haustoria, the collar(C)around ahaustorial neck, the haustoral wall and protoplasm were disintegrate(×7200);Ⅱ-6.There are weakly stained granular-like material in the extrahaustorial matrix (EM), which waswider, the extrahaustorial membrane broken under the haustoria(arrow s)(×5000)

花斑明显时, 菌丝细胞内颗粒状物质增多, 出现大量的多聚核糖体, 细胞紊乱程度增加, 原生质进一步解体, 液泡增多。病菌受抑程度较花斑初显时增加, 当入侵栓侵入成功后迅速被寄主的原生质包围, 原生质中充满管状复合体、胼胝质及线粒体, 吸器缩小, 吸器壁染色加深, 吸器未能正常发育(图版Ⅱ-5)。吸器颈部壁及吸器壁增厚, 质膜染色程度加深, 吸器外膜上出现大量的黑色粒状沉积物; 外间质逐渐扩大, 内部沉积大量的颗粒状物, 尤其在寄主质膜上密度较大; 吸器下部的吸器外质膜断裂, 断裂部位加粗呈蝌蚪型, 染色加深(图版Ⅱ-6)。寄主叶绿体中的淀粉粒消失, 叶绿体等细胞器开始解体, 细胞空泡增大, 最终坏死。

花斑初显时, 菌丝体扩展范围较小, 形态异常, 细胞质染色程度加深, 原生质紊乱, 空泡体积增大, 细胞器部分解体。花斑明显时, 菌丝体严重畸形, 原生质液泡化, 细胞壁加厚, 染色加深, 菌体濒死或已坏死。

在花斑初显时可形成正常的吸器母细胞, 入侵部位细胞壁加厚, 乳突明显; 即使在表皮细胞中也有吸器产生, 但来自于胞间菌丝(图版Ⅲ-1)。侵入寄主后, 吸器颈部及整个吸器迅速被寄主分泌的不规则型的深色物质所包围, 颈环及吸器周围的外间质加宽, 充满颗粒状沉积物; 吸器畸形, 原生质浓缩, 染色较重, 脂肪粒增多, 核膜解体、质膜分离(图版Ⅲ-2)。菌体进一步发育到花斑明显时, 吸器受抑及坏死现象更加明显, 吸器均被寄主细胞的分泌物所包围, 被包围的吸器解体成为空腔坏死, 或畸形变黑坏死。大多数吸器在花斑初显时已坏死或濒临坏死, 偶尔可看到正常的吸器。

图版Ⅲ 近免疫品种中的病原菌形态及寄主细胞反应 Plate Ⅲ Form of pathogens and the reaction of host cell in near-immune species Ⅲ-1.寄主表皮细胞中的幼小双核吸器, 含吸器的寄主细胞壁加厚, 胞间菌丝及吸器母细胞中含有多聚核糖体(×5000);Ⅲ-2.即将坏死的吸器, 双核吸器的核膜消失, 原生质颗粒化(×14000);Ⅲ-3.受侵细胞相邻的寄主细胞颗粒化(GRC)(×3600);Ⅲ-4.寄主细胞壁加厚, 原生质及核、吸器均一颗粒化, 叶绿体(CH)尚完整(×4000);Ⅲ-5 ~ 6.寄主细胞核(N)、叶绿体(CH)解体, 细胞空泡化(×2500) Ⅲ-1. The haustorium with both nuclei (N)in the epidermal cell and the host cellwallswere thickened(×5000);Ⅲ- 2.Haustorium nearly died, nuclear membrane to disappear, the protoplasm were grain(×14000);Ⅲ-3.The neighbouring cells of invaded host cell were grain(GRC)(×3600);Ⅲ-4.The invaded host cell wall was thickened, protoplasm cell nucleus and haustorium were grain, but the chloroplast(CH)still normal(×4000);Ⅲ-5~ 6.The host cell nucleus(N) and chloroplast(CH)disintegrate the cell vacuolate(×2500).

寄主细胞在花斑初显时, 对病原菌的入侵反应就表现的更为强烈, 细胞壁明显增厚, 细胞膜消失, 细胞颗粒化或成为空腔(图版Ⅲ-3)。侵染细胞的相邻细胞已空泡化, 部分原生质已解体, 线粒体等未解体的细胞器的形态已发生变化, 并聚集仅留下染色较深的吸器壁, 随后吸器及寄主细胞坏死。

花斑明显时, 吸器母细胞及吸器解体为颗粒状或空腔, 寄主细胞中的细胞器部分解体, 叶绿体网格状, 淀粉粒逐渐缩小, 最后消失(图版Ⅲ-4~6)。最后整个寄主细胞颗粒化或成为空腔, 吸器已成为空腔, 仅留下染色较深的吸器壁, 随后吸器及寄主细胞坏死, 整个寄主细胞颗粒化或成为空腔。

对落叶松—杨栅锈菌(M. larici-populina Kleb.)与不同杨树种或品种互作过程中的细胞学研究, 得出以下结论:

非亲和性组合中, 病菌的侵染结构都不同程度的受到了抑制, 受抑情况及程度因抗性组合不同而不同。表现为菌丝体内出现空泡和球形脂肪粒, 菌体染色加深, 细胞质出现紊乱; 菌丝数量减少、畸形, 细胞壁加厚, 染色加深; 液泡体积增大, 细胞器部分解体, 菌体濒死或已坏死。

吸器受抑及坏死的表现和出现时间在各抗病组合中基本相似, 主要表现在:菌体内出现颗粒状物质和多聚核糖体, 细胞紊乱程度增加, 原生质解体; 颈环附近沉积有大量的胼胝质物质; 吸器畸形, 染色加深, 形状不规则, 外膜上沉积大量的黑色粒状物; 原生质中液泡及脂肪粒增多, 线粒体肿胀。

寄主细胞对病原菌入侵的反应, 在不同的品种—菌种组合中表现程度不同。锈菌在寄主细胞间隙或沿寄主细胞壁延伸时, 感病品种的叶肉细胞保持正常状态。抗病性组合种, 与菌丝接触部位的寄主细胞壁明显增厚, 并产生乳状突; 细胞壁与质膜之间出现黑色沉积物; 寄主细胞分泌不同形态的分泌物包围吸器; 细胞器与吸器相伴随, 细胞器大量向吸器周围聚集; 叶绿体畸形, 淀粉粒肿胀并逐渐缩小而消失; 质壁分离, 内膜上沉积大量的深色颗粒状物; 细胞膜破裂, 染色加深; 细胞质紊乱, 细胞器解体, 细胞颗粒化或空泡化。中抗品种的细胞解体后, 与受侵细胞相邻的寄主细胞仍很正常; 高抗与近免疫品种中受侵细胞相邻的寄主细胞不同程度的发生解体或坏死。

寄主细胞坏死晚于吸器坏死。当吸器畸形或坏死时, 寄主细胞中的细胞器仍很正常; 随着侵染程度的进一步发展, 出现吸器与寄主细胞都坏死的现象, 但未观察到坏死寄主细胞中有正常吸器的现象。因此, 侵入后吸器的坏死是导致寄主细胞死亡的原因。寄主过敏性坏死反应与其它锈菌相似。

锈菌为高度专化寄生菌, 具有变异快、易产生新小种的特点, 诸如小麦条锈菌的菌丝体及吸器中的多核现象被认为是变异的现象或途径之一(康振生, 1996)。栅锈菌的吸器母细胞在细胞壁、细胞核及隔膜的结构和形态上与其它锈菌很相似, 但栅锈菌的菌丝、吸器母细胞、吸器体中的细胞核数目变化不大, 多为双核, 少数为单核, 未发现多核现象。

非亲和组合中寄主的抗性表达主要表现在乳突、胼胝质的形成, 吸器外包被物以及管状复合体的出现等。入侵栓不能穿透寄主细胞, 被认为是由于乳突的阻挡作用(Niks, 1986; Taylor et al., 1991)。Omar和Heather (1979)发现M. larici-populina的夏孢子芽管可直接穿透寄主表皮入侵, Shain和Jarlfors (1987)也发现M. medusae可直接侵入P.deltoides的表皮, 但病菌仅仅穿透了寄主表皮细胞, 未能进入到叶肉组织中。原因是穿透寄主表皮的入侵栓被寄主产生的乳突状物包围, 进而限制其发育, 最终使侵入失败。而乳突中具有大量的木质素、纤维素、木栓质等使其通透性较差, 同时较高浓度的硅可抵抗来自入侵栓产生的机械压力, 阻止吸器的形成(Asit, 1976)。抗性最初的表达是入侵部位产生的沉积物, 沉积物的强度因品种—菌种组合不同而有所区别, 强度较高时才可有效抑制入侵(Heath, 1971)。作者未发现芽管直接侵入表皮的现象, 但在近免疫、高抗、中抗品种, 甚至在中感品种中吸器的入侵栓周围也发现了乳突状沉积物, 而感病品种中尚未发现有乳突形成, 说明乳突的强度对入侵影响很大。

吸器外包被物的出现与寄主的抗性有关(Heath, 1971; Coffey et al., 1983)。在吸器形成过程中, 寄主分泌的包被物阻碍吸器吸收营养功能的发挥, 使其不能正常吸收营养而导致坏死。本研究发现不同杨树与菌种组合中, 吸器外包被物的产生强度与抗性强弱有关, 中抗品种的外包被物量较少、密度较小, 出现的也较晚; 高抗与近免疫品种在入侵栓侵入到寄主细胞后, 在颈部及吸器周围出现大量的外包被物, 吸器未能正常发育而坏死。在多个非亲和组合中的吸器外间质中均观察到深色颗粒状或丝状沉积物, 显示与抗病性有关。以往的许多研究结果也说明这些沉积物是抗病性的决定因素(康振生, 1996)。对于上述外包被物及沉积物的产生及作用机理尚不清楚, 有必要进行更深入的研究。

胼胝质在许多锈病菌中都有发现, 当锈菌侵入寄主细胞时, 寄主细胞分泌大量的胼胝质将颈部包围起来, 有时形成围领结构(康振生等, 1993; Litlefied et al., 1979), 胼胝质主要是多糖物质, 它的出现与寄主抗病性无关(康振生等, 1993)。本研究发现在感病杨树品种中很少形成围领结构, 而抗病品种上较为普遍, 这可能与寄主对病菌的反应有关, 但是否与抗病性有关, 目前尚无直接证据。

落叶松—杨栅锈菌的抗性组合种, 寄主细胞中积累大量的淀粉粒。当寄主细胞即将坏死时, 其它细胞器已先于叶绿体解体, 此时叶绿体中的淀粉粒逐渐缩小, 最终随叶绿体的解体而迅速消失。Coffey (1976)认为淀粉粒的消失说明可溶性糖的积累减少, 这是抑制病菌菌落扩展的重要因素(Coffey, 1976)。本研究还发现在健康的高抗或近免疫品种的保卫细胞中存在大量的淀粉粒, 而感病品种的保卫细胞中淀粉粒较少或缺乏, 这一现象是否与寄主的抗病性有关尚需进一步研究。