银杏是新生代第四纪冰川期的孑遗树种, 为我国独存的珍稀名贵树种。它既可作为园林绿化和观赏树种, 也是优良木材, 且其种子、叶片富含营养及药用成分。银杏的用途广泛, 经济价值很高。随着银杏开发利用及其潜在价值的不断发现, 发展良种银杏产业势在必行。特别是西部地区的开发, 对银杏苗木的大量需求更是迫在眉睫; 但银杏是雌雄异株的裸子植物, 生长周期长。应用现代生物技术, 对银杏苗木进行快速繁殖和工厂化生产, 具有极大的现实意义。

组织培养的最大优点是大量快速繁殖, 可以用极少量的材料获取大量幼苗; 正交试验是一种理想的部分试验设计方案。在银杏组织培养方面, 前人和同行们做了很多卓有成效的研究工作。但迄今所见多以幼胚、胚乳为外植体(李继侗, 1986; 王伏雄等, 1963; 1965; 吴元立等, 1998; Carrier et al., 1990), 或以胚切段胚轴部位培养(罗紫娟, 1984), 以及采用种仁、胚、胚轴、子叶、成熟株腋芽等为外植体¹⁾; 以成熟株材料进行组培则少见获得理想结果(Gupta et al., 1987a)。本研究采用植物组织培养法, 在合适时间采取银杏当年生茎段, 按正交试验设计对银杏进行了条件筛选研究, 通过正交试验从多个因素中找出影响试验结果的各因素的主次顺序和交互作用, 从中找出最佳结果, 并确定了培养基中最显著影响因素。

1) 沈敏娟.银杏之组织培养.台湾大学森林学研究所硕士论文, 1992:3~5.

1 材料和方法 1.1 试验材料

接种材料为4月份生长旺盛的银杏多年生植株上当年抽生幼嫩茎段, 剪去叶片, 截取带芽外植体。

1.2 新材料消毒

将截取的带芽外植体清水浸泡清洗, 再用70%酒精消毒30 s, 无菌水冲洗3~5遍后转入无菌条件下, 用0.1%的升汞浸泡10 min, 取出材料再用无菌水冲洗3~5遍。在无菌条件下将外植体切成0.8~1.0 cm的茎段, 每个茎段带一个芽, 转入消毒过的培养皿中备用。

1.3 培养基配制

本试验采用MS基本培养基, 附加3种不同浓度的活性炭、6-BA、NAA, 按正交表L₉ (3⁴)前3列列成不同的试验配比, 正交表中列号1、2、3分别对应活性炭、6-BA、NAA 3个因素, 活性炭列对应3个水平:①0, ②0.2%, ③0.5%;6-BA列对应3个水平:①1.0 mg·L^-1, ②2.0 mg·L^-1, ③3.0 mg·L^-1; NAA列对应3个水平:①0.1 mg·L^-1, ②0.5 mg·L^-1, ③1.0 mg·L^-1。培养基蔗糖浓度为30 g·L^-1。正交表和9种培养基的详细配比如表 1和表 2。

1.4 培养基及实验器具的消毒

将培养基及接种所需各种器皿均放入高压锅内消毒; 压强升至0.5 kg·cm^-2时打开阀门放出冷空气, 继续加热, 压强升至1.1 kg·cm^-2时, 计时20 min停止加热, 自然冷却后取出放入接种室备用, pH值调节为5.4~5.8。

1.5 培养的环境条件

银杏茎段培养温度为25℃±2℃, 光强为1000~2000 Lux的日光灯照明, 10 h光照, 14 h黑暗。

2 结果与分析 2.1 银杏茎段培养芽分化和增殖表现 2.1.1 各培养基对银杏茎段分化影响

银杏茎段接种以后, 根据培养基中活性炭及激素配比的不同, 各组合都程度不同地出现器官发生现象, 其中没有加活性炭的前3组配比中均只出现愈伤组织和芽点, 有活性炭的后6组配比均有芽分化, 实验结果如表 3所示。

表 3表明, 茎段分化率以5、7、8号为最高, 达100%, 其中均加有活性炭成分。

2.1.2 各培养基对银杏微繁增殖影响

分化的茎段进行继代培养。银杏茎段经过继代培养19 d后, 各培养基中茎段萌芽均有不同程度增殖(发叶、萌芽), 折算成百分比列入表 4。

表 4的统计结果表明, 第7种培养基MS+活性炭0.5%+6-BA1.0 mg·L^-1+NAA0.1 mg·L^-1增殖率最高, 达68%。

无论是分化率还是增殖率, 活性炭的最佳浓度为第3个水平A₃:0.5%, 6-BA的最佳浓度为第2个水平B₂:2.0 mg·L^-1, NAA的最佳浓度为第2个水平C₂:0.5 mg·L^-1, 过高或过低均不利于萌芽率和分化率的提高。图 1和图 2为不同水平浓度的各因素作用曲线图。

从两个曲线图可以清晰地看出, 以茎段为外植体的分化和增殖趋势随活性炭浓度增大而增大; 6-BA与NAA则不然, 均以浓度适中(6-BA水平2.0 mg·L^-1; NAA水平0.5 mg·L^-1)为宜, 过大或过小其效果都呈下降趋势。

2.2.2 各因素影响结果的方差分析表

表 5与表 6结果表明, 3个因素对继代19 d时的增殖率影响其不同水平之间的差异都达到显著或极显著水平; 对接种10 d时的分化率影响, 只有活性炭各水平之间达到显著水平, 6-BA和NAA都未达到。进一步说明活性炭及其水平高低对银杏茎段的快繁作用不可低估。

2.3 不同采样时间对茎段分化率的影响

采样时间的不同, 茎段的幼嫩程度不同, 太嫩则在消毒时细胞容易失活而造成外殖体的死亡, 但如果木质化程度高则容易感染, 成活率也会随之下降, 同时, 木质化程度高细胞分化难, 从而导致分化率的下降。

表 7为不同采种时间对分化率影响的分析结果, 从中可以看出适宜采样时间为4月中、下旬。过早或过晚都会影响萌芽率的提高。

3 结论

银杏茎段试管培养研究, 从国内外一些文献记载来看, 成功的例子不多, 这与试验材料取样时间、培养基配方、培养条件等多种因素有关, 本次试验以多年生植株4月中、下旬当年抽生茎段为材料, 选择MS基本培养基辅以适宜的其它条件, 可以取得较好的成效。

3.1 银杏茎段试管培养再生途径

银杏组织培养利用茎段微繁, 存在先诱导愈伤组织、后分化或直接分化、增殖的两种再生途径, 从本试验结果与笔者先前所做试验(胡蕙露等, 1997)可以互相验证; 分析原因主要受培养条件和取样时间制约。

3.2 银杏茎段试管培养最佳条件筛选

正交试验及其方差分析筛选出最佳培养基为MS+活性炭0.5%+6-BA1.0 mg·L^-1+NAA0.1 mg·L^-1, 其分化率最高; 就各因素而言, 活性炭以0.5%水平最佳, 6-BA以2.0 mg·L^-1水平最佳, NAA以0.5 mg·L^-1水平为宜。培养基组合之间的协调与各因素的临界最佳发挥并不矛盾。

3.3 活性炭对银杏茎段试管培养的作用

在银杏茎段培养中, 活性炭对外植体芽的分化和培养增殖, 具有非常重要的作用, 较之激素6-BA和NAA效果明显; 随着活性炭水平(浓度)的提高, 分化率、增殖率都呈上升趋势。活性炭为3个因素中最活跃的因素, 并有防止褐化和促进生长的效果。高于0.5%浓度的活性炭作用有待试验。活性炭是银杏组织培养中关键、敏感的培养条件, 而这一点, 一直没有受到很多甚至富有经验的组培研究者所重视。

3.4 取样时间对银杏茎段试管培养的影响

取样时间对植株分化和再生有一定影响, 最佳取样时间为4月中、下旬, 过早或过晚分化率都有所下降; 可能与银杏成熟植株本身各发育阶段有关。

3.5 银杏组织培养的应用

银杏组织培养在生产上的应用和推广前景广阔; 可以肯定的是, 它必将为银杏工厂化生产及银杏遗传资源的保存和利用, 提供一定的应用价值和学术价值。