林木经常遭受各种自然逆境的胁迫, 而水分胁迫(water stress)在众多自然逆境中位居首位, 其它种类的环境胁迫都是首先通过水分胁迫造成细胞膜系统状态发生改变而触发一系列水分伤害反应的, 因而水分胁迫严重限制林木的正常生长发育。近百年来, 逆境生理学(stress physiology)积累的大量资料充分表明水分胁迫在多种水平上干扰大量生理活动的正常进行以及不同的生理过程对水分胁迫的响应和适应程度存在较大的遗传变异性。绝大多数研究认为水分胁迫普遍降低植物叶绿素和蛋白质含量并提高RNase活力。水分胁迫促使RNase活力升高的原因异常复杂, 目前存在5种观点解释水分胁迫状态下RNase活力升高的原因(王万里, 1981; 叶金山等, 1992)。这些结论基本上都是以草本植物为材料研究得出的, 而以林木为材料的研究非常少。在林木遗传育种学和林木逆境生理学等领域中有关水分胁迫影响杂种F₁与原始双亲上述重要生理性状的研究极其薄弱。已故著名林木遗传育种学家叶培忠教授于1963年运用人工杂交方法选育的正交杂种马褂木(Liriodendron chinense (Hemsl.) Sarg.×L.tulipifera Linn.)及其反交杂种不仅表现出强大的生长、适应性和抗性正向杂种优势, 而且具有材料完备和谱系清楚的突出特点, 因而是研究林木杂种优势的极好材料(南京林产工业学院林学系育种组, 1973; 南京林产工业学院, 1980; 张武兆等, 1997)。本文以鹅掌楸属种间正反交杂种F₁与原始双亲为材料, 探讨水分胁迫对叶片相对含水量、叶绿素含量、蛋白质含量和RNase基因表达等生理性状的影响, 希望从中找出杂种马褂木生长、适应性和抗性杂种优势形成的分子机理, 从而为解释杂种优势表现和机理以及开展更深入的遗传改良提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

马褂木(代号C)和北美鹅掌楸(代号T)为叶培忠教授早期杂交的原始亲本植株, 分别定植于南京林业大学校园和南京明孝陵; 正交杂种(代号F₁)和反交杂种(代号F_{1 (-)})为定植在南京林业大学校园的成年树植株。试验叶片选取上述植株树冠中下部东面受光充分并且生长一致的枝条顶芽下第4叶。1997-07-24~08-08取样测定水分胁迫状态下叶片的相对含水量、叶绿素含量、蛋白质含量和RNase活力; 1997-09-30~10-05取样进行RNase的抑制剂处理和放射性标记。

1.2 水分胁迫处理

叶片用卫生纸擦净后送入温度31.1℃、光强20 μmol Photos·m^-2s^-1的光照恒温箱进行干旱处理。每小时变动1次叶片位置。按研究需要在规定时间取出制样。所有试验叶片均在水分胁迫前确定取样面积, 胁迫后不因失水而增加叶片面积, 一律按胁迫前确定的叶面积计算。

1.3 相对含水量测定

参照王万里方法(1981), 叶片在DF160型电子分析天平上称重, 并按相对含水量(RWC) = (原初鲜重-干重) / (水饱和鲜重-干重) ×100%的公式计算, 其中水饱和鲜重和干重分别指叶片飘浮蒸馏水中4 h和85℃干燥箱烘干24 h的重量。RWC取5片叶平均值。

1.4 叶绿素含量测定

参照Arnon法(1949)。叶片加适量石英沙和丙酮(浓度 > 99.5%)研磨, 匀浆采用台式离心机在4℃冷室13600 g离心20 min, 取上清液用国产7230型分光光度计测定吸光度(A)。

1.5 酶液制备

叶片放入预先冰冻的玻璃研钵中, 加适量石英沙和0.05 mol HAc-NaAc缓冲液(pH4.8)研磨, 匀浆用台式离心机在4℃冷室13600 g离心20 min, 取上清液定容作为粗酶液用于蛋白质和RNase活力测定。所有提取步骤均在冰浴中进行。

1.6 蛋白质含量测定

参照Bradford (1976)描述的Coomassie brilliant blue G₂₅₀染色法测定。测定仪器为国产7230型分光光度计。

1.7 RNase活力测定

RNase活力测定参照Hanson方法(Hanson et al., 1969), 并稍加修改。反应混合液含有1 mL酵母RNA (1 mg·mL^-1)、0.05 mL 30 mmol硫基乙醇、0.1 mL酶液和0.35 mL 0.05 mol HAc-NaAc缓冲液(pH4.8)。反应混合液在37℃下保温30 min, 然后放入冰浴中3~4 min后加入1.5 mL冷却0.02 mol La (NO₃) ₃-0.2 mol HCl试剂, 强烈搅拌混合液并用台式离心机在4℃冷室13600 g离心20 min。用日本产UV-120-02型分光光度计测定上清液在λ=260 nm波长下的O.D值。规定1个酶活力单位为反应混合液中0.1 mL酶液在30 min内催化形成O.D值为0.1的镧酸可溶性碎片的酶量。酶活力取3次测定平均值。

1.8 ³H-甘氨酸参入

在叶片中脉中间部位并以中脉为对称轴左右各取对称的3 cm×4 cm叶片。将所取叶片放入³H-甘氨酸(Gly)溶液(100 μL浓度1 mci·mL^-1、比度5 ci·mmol^-1的³H-Gly定容至100 mL)标记20 h, 用蒸馏水充分漂洗, 然后将标记叶片分别进行充分供水(对照)和脱水处理6 h。

1.9 亚胺环己酮前处理

按与³H-Gly参入相同方法选取叶片。将叶片在50 mg·kg^-1亚胺环己酮(cycloheximide, CHM)溶液中培养20 h作为前处理。蒸馏水充分清洗后, 把经CHM前处理和未经CHM前处理的叶片分别进行充分供水(对照)和脱水处理6 h。

1.10 标记RNase纯化与测定

标记RNase的纯化采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)。浓度7.5%的标准凝胶、分离胶pH8.9、浓缩胶pH6.7、样品胶为样品液加20%蔗糖、电极缓冲液pH8.3。电泳完毕, 从管中剥出凝胶, 放入含有4 mL预先保温的0.05 mol HAc-NaAc (pH4.8)试管中, 在37℃保温20 min, 倒出缓冲液, 加入4 mL酵母RNA (1 mg·mL^-1), 37℃保温10 min, 倒出RNA溶液, 加入4 mL预先保温的缓冲液再保温5 min, 最后把凝胶放入用0.1%醋酸配制的0.2%甲苯胺蓝溶液中染色30 s, 取出凝胶并放在水中漂洗, 然后放入0.5%醋酸的小试管中, 醋酸在1 h内更换3次。在20 min内出现表示酶活性的无染料的白色带, 用蒸馏水代替醋酸。切下未被染色的RNase带并切成约1 mm厚薄片, 浸入0.2 mL 0.05mol HAc-NaAc缓冲液(pH4.8)中48 h, 以便RNase从凝胶扩散到缓冲液中。

将吸取的50 μL含有纯化³H-Gly标记RNase的缓冲液放入BECKMAN LS9800型液闪谱仪中测定RNase中³H-Gly的衰变数/min (DPM)。

2 结果与分析 2.1 相对含水量变化

表 1揭示水分胁迫状态下亲本与杂种叶片水分状况的变化存在巨大差异。按照Hsiao (1973)对中生植物的水分胁迫程度所作的划分标准, 水分胁迫2 h, C已达严重胁迫(RWC下降24.2%); T和F₁达中度胁迫(RWC分别下降16.4%和12.0%), 而F_{1 (-)}仅为轻度胁迫(RWC下降6.7%)。随着胁迫时间延长, C失水速度急剧加快并显著超过T和正反交杂种。水分胁迫导致细胞膨压(ψ_p)降低。Hsiao (1973)非常重视膨压(ψ_p)的影响, 认为ψ_p降低在水分胁迫的影响中具有最原初和基本的性质, 而植物很多生理过程或指标在组织水势降低0~10³·kPa范围内是非常敏感的。水分胁迫状态下C叶片相对含水量急剧下降的事实充分表明马褂木对水分胁迫的敏感性显著高于北美鹅掌楸和正反交杂种F₁, 短时间干旱足以造成对马褂木的严重伤害。

2.2 叶绿素含量变化

从表 2数据可以看出, 水分胁迫3 h, C叶绿素已破坏37.6%, T丧失28.6%, 而正反交杂种F₁的损失不足10%。随着胁迫加强, 亲本叶绿素含量降低幅度远大于杂种, 而亲本中马褂木叶绿素破坏速度又明显大于北美鹅掌楸, 杂种中正交F₁的破坏速度大于反交F₁。水分胁迫引起气孔或非气孔因素的限制从而降低光合作用(Boyer et al., 1983)。叶绿素存在于光合作用器官叶绿体中, 因而表 2叶绿素含量指标的下降程度同时也反应了光合机构的破坏程度, 清楚表明水分胁迫对马褂木光合作用造成的危害最大。

2.3 蛋白质含量变化

水分胁迫3 h, C蛋白质含量降低40.6%, T降低26.5%, 而F₁和F_{1 (-)}分别降低9.8%和7.6%。随着胁迫时间延长, 正反交杂种蛋白质破坏速度仍然远小于亲本(表 3)。水分胁迫干扰植物体氮代谢过程的最突出表现就是蛋白质分解, 从而提高游离氨基酸含量(王万里, 1981)。马褂木蛋白质降解速度明显高于北美鹅掌楸和杂种F₁, 表明马褂木对水分胁迫具有最强的敏感性, 因而短时间水分胁迫对马褂木的危害性也最大。此外, 光合碳同化中的重要限速酶Rubisco (核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶/加氧酶; EC4.1.1.39)在植物体内含量极高, 约占叶蛋白的50%以上。短时间水分胁迫造成马褂木叶总蛋白含量大幅度下降而Rubisco作为叶片中最丰富的蛋白质自然首当其冲, 必然随之遭到严重破坏, 从而对光合作用构成极大危害。

2.4 RNase基因表达 2.4.1 RNase活力变化

表 4数据说明双亲与杂种叶片RNase活力对水分胁迫的响应都非常敏感, 短时间水分胁迫明显提高RNase活力; 随着胁迫时间延长, RNase活力一直增加, 直至永久萎蔫点。这与大多数情况下水分胁迫促进草本植物和一些木本植物(苹果、刺槐) RNase活力升高的趋势相一致(Hsiao, 1973; Brandle et al., 1977; 王万里, 1981; 叶金山等, 1992)。表 4同时也指出, 尽管水分胁迫使亲本与杂种叶片RNase活力都升高, 但它们对水分胁迫的敏感性却存在较大变异性。水分胁迫3 h, C的RNase活力增加53.4%, T增加11.9%, 而F₁和F_{1 (-)}仅分别增加7.5%和6.7%。显然, 从RNase活力对水分胁迫敏感性角度可将4者抵抗水分胁迫的能力排序为:反交F₁ > 正交F₁ > 北美鹅掌楸 > 马褂木。

植物RNase是水解RNA链磷酸二酯键的核酸内切酶, 与植物的生长、分化、衰老、种子成熟和萌发等多种生理过程有密切关系。水分胁迫状态下RNase活力提高首先促进mRNA分解, 并使多核糖体降解为亚单位或单核糖体, 从而抑制蛋白质合成, 进而加速分解mRNA、tRNA和snRNA。因此水分胁迫时RNase活力的提高直接破坏与基因转录和翻译紧密相关的核酸系统, 无疑会对植物生长发育产生广泛而深远的危害。据实际观察, 在南京地区, 马褂木9月中旬已开始大量落叶, 全树1/5~1/3的树叶已变黄色, 但北美鹅掌楸和正反交杂种植株此时却无落叶现象, 全部树叶均为翠绿色。这与文献报道的马褂木情形一致, 但却与文献报道的北美鹅掌楸表现不一致(南京林产工业学院林学系育种组, 1973; 南京林产工业学院, 1980)。水分胁迫状态下杂种与双亲叶片的RNase活力、叶绿素含量和蛋白质含量的差异性变化规律的发现为理论上解释上述现象提供了充分的分子生物学证据。

2.4.2 ³H-Gly参入效应

亲本与杂种叶片的RNase经聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳显示1条区带, 表明³H-Gly标记RNase已得到纯化。

与充分供水对照相比, 水分胁迫同时提高亲本与杂种叶片的RNase活力和DPM值, 但增加幅度在4者之间呈现较大差异(表 5)。水分胁迫6 h, C叶片RNA活力和DPM值分别提高31.5%和65.7%, T分别增加13.6%和4.0%, 而F₁和F_{1 (-)}二项指标的变化都非常小(表 5)。水分胁迫状态下马褂木叶片RNA的³H-Gly参入量远高于北美鹅掌楸和正、反交杂种F₁的参入量, 从而取得了水分胁迫导致亲本与杂种叶片RNase基因在翻译水平上表达而从头合成RNase以及4者基因表达强度差异性的直接证据。水分胁迫导致亲本与杂种从头合成RNase的结论与Brandle和叶金山等对刺槐实生苗水分胁迫状态下RNase活力变化的研究报道相似(Brandle et al., 1977; 叶金山等, 1992)。

2.4.3 CHM前处理效应

从表 6数据可以看出CHM前处理对水分胁迫状态下RNase基因表达的抑制效应随试验叶片不同而变化。CHM前处理强烈抑制双亲充分供水与水分胁迫叶片的RNase活力, 但对正反交杂种F₁的抑制效应却都非常微弱。间接证据再次表明水分胁迫状态下双亲RNase基因表达强度非常高, 而正反交杂种F₁的RNase基因表达强度比较低, 双亲中马褂木RNase基因表达强度又明显高于北美鹅掌楸; 杂种中正交F₁的RNase基因表达稍微强于反交F₁。间接证据与直接证据一致。

蛋白质生物合成抑制剂CHM作用于真核细胞80S核糖体的60S亚基而抑制肽酰转移酶活性从而抑制真核细胞的翻译, 但CHM不能抑制真核细胞中内共生起源的带72S核糖体的叶绿体和线粒体的翻译。国际上自20世纪80年代以来兴起有关环境胁迫诱导逆境蛋白的研究热点。Nebiolo和White (1985)在高温处理4个玉米品种线粒体的研究中发现线粒体是热刺激的重要目标, 高温诱导能产生热激蛋白并释放到线粒体外去。贺志理和王洪春(1991)报道盐胁迫在抑制苜蓿叶片蛋白质合成的同时, 能增强离体叶绿体的蛋白质合成, 诱导一些新的多肽出现, 不同品种有不同的分子量、不同的叶绿体内定位, 而且脱落酸的影响也不同。在CHM前处理条件下水分胁迫造成C叶片RNase活力升高23.6%, T升高2.0%, 而F₁和F_{1 (-)}分别下降9.3%和7.5% (表 6)。本文初步认为水分胁迫时双亲RNase活力升高除与细胞质的mRNA翻译有关外, 还可能涉及到叶绿体和/或线粒体RNase的释放、活化和/或合成, 而正反交杂种F₁的RNase活力升高可能主要来自细胞质mRNA的翻译而不涉及叶绿体和/或线粒体。由于CHM的作用是多方面的以及逆境蛋白基因表达的复杂性, 因此彻底阐明鹅掌楸属亲本与杂种水分胁迫状态下RNase基因表达细节仍有大量工作要做。考虑到翻译在整个基因表达和生化代谢中的中心作用, 充分利用多种有效的翻译抑制剂研究逆境蛋白基因在翻译水平上的表达无疑是十分重要的。

3 结论

水分胁迫状态下鹅掌楸属的亲本与杂种叶片相对含水量降低速度存在明显差异, 从大到小排序为马褂木 > 北美鹅掌楸 > 正交F₁ > 反交F₁; 短时间失水已对马褂木构成严重水分胁迫。

水分胁迫状态下鹅掌楸属的亲本叶绿素破坏速度远大于杂种, 而亲本中马褂木破坏速度又明显大于北美鹅掌楸, 杂种中正交F₁破坏速度大于反交F₁。

水分胁迫状态下叶片蛋白质含量下降速度排序为马褂木 > 北美鹅掌楸 > 正交F₁ > 反交F₁。短时间水分胁迫大幅度降低马褂木叶片的蛋白质含量。

水分胁迫提高亲本与杂种叶片的RNase活力; 4者的RNase活力对水分胁迫响应的敏感性排序为马褂木 > 北美鹅掌楸 > 正交F₁ > 反交F₁; 短时间水分胁迫造成马褂木RNase活力大幅度提高。

³H-Gly取得的直接证据揭示水分胁迫导致亲本与杂种RNase基因在翻译水平上表达而从头合成RNase以及4者的RNase基因表达强度存在较大差异:RNase基因表达强度排序为马褂木 > 北美鹅掌楸 > 正交F₁ > 反交F₁。

蛋白质生物合成抑制剂取得的间接证据表明水分胁迫状态下双亲RNase活力升高除与细胞质mRNA翻译有关外, 还可能涉及叶绿体和(或)线粒体RNase的释放、活化和(或)合成, 而正反交杂种F₁的RNase活力升高可能主要来自细胞质mRNA的翻译而不涉及叶绿体和(或)线粒体。

上述分子水平的实验事实充分证明杂种马褂木正反交F₁杂种具有对水分胁迫抗性的显著超亲杂种优势, 而正反交杂种中反交F₁的抗性又强于正交F₁。因而研究结果在理论上从水分胁迫抗性差异角度揭示了杂种马褂木强大正向生长、适应性和抗性杂种优势现象形成的分子机理, 而在实践上则指出杂种马褂木杂种优势的固定利用工作应特别注意反交F₁杂种无性系的选育与开发。