植物愈伤组织器官发生是细胞顺序启动基因的表达过程。在这一过程中与器官发生有关的基因不断地表达, 产生相应的蛋白(黄学林等, 1995)。研究器官发生过程中的蛋白可以帮助我们认识器官发生的相关基因和深入了解细胞分化和发育的内在生理生化过程。对半寄生性的独脚属植物Striga hermonthica发育分子标记研究发现4个特异的水溶性蛋白与其种子萌发和寄生附着有着密切的关系(Adriana et al., 1999); 在甜瓜子叶中已发现一组多肽(20 ~ 25 kDa)与子叶器官发生密切相关(Leshem et al., 1990); 在大麦胚和根脱分化诱导愈伤组织形成时发现有32个蛋白是特异产生的, 其中一些蛋白可以作为脱分化和细胞发育的分子标记(Ramagopal et al., 1989)。目前这一方向的研究正处于不断地丰富和深入之中。

胡杨是耐盐性极强的乔木树种, 但其常规无性繁殖困难(王世绩, 1996; 魏庆莒, 1990)。在对胡杨体细胞再生植株的研究发现:其愈伤组织的形成、继代和器官发生过程表现出了明显的规律性调节和发育的阶段性。培养基中BA/NAA值为1时诱导产生的茎基愈伤组织有极强的不定芽发生潜力, 当将其转移培养至BA/NAA值大于1的培养基中会诱导发生不定芽; 而转移培养在BA/NAA小于1培养基上进行愈伤组织的扩增, 不定芽的发生过程则直观地表现出白色愈伤组织、愈伤组织表面形成绿色小岛和由小岛产生不定芽3个阶段(谷瑞升等, 1999)。因而, 胡杨愈伤组织的器官发生体系可以成为研究植物器官发生调控机制的较好模式。为此, 我们对胡杨愈伤组织继代培养和器官发生过程中表达的蛋白进行了研究, 以期在分子水平上认识器官发生过程。

1 材料和方法

试验采用的基本培养基为MS并附加40 mg·L^-1 ADE、500mg·L^-1 CH、25 g·L^-1蔗糖和2.2 g·L^-1 Phytogel。培养温度为25 ℃±5 ℃, 光照强度为2000 lx, 10 h·d^-1光照, 14 h·d^-1黑暗。

1.1 愈伤组织的诱导

胡杨试管苗培养于附加0.5mg·L^-1 BA和0.5 mg·L^-1 NAA(BA/NAA为1)的基本培养基上, 经过30 d培养, 在试管苗的茎基产生愈伤组织。

1.2 愈伤组织的继代增殖培养

培养基为附加0.25 mg·L^-1 BA和0.5 mg·L^-1 NAA(BA/NAA为0.5)的基本培养基。每25 d继代1次, 培养在全黑暗下进行。

1.3 愈伤组织的不定芽诱导

培养基为附加0.5 mg·L^-1 BA和0.1 mg·L^-1 NAA(BA/NAA为5)的基本培养基。

1.4 蛋白分析

采用优化方法提取蛋白和进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(谷瑞升等, 1999)。对SDS-PAGE电泳结果进行薄层扫描分析, 扫描采用Shimadzu CS-930双波长薄层扫描仪。蛋白分子量根据其Rf值确定。

等电聚焦双向电泳(IEF/2D)见谷瑞升等(1999)方法, 蛋白的pI值根据蛋白等电聚焦位置确定, 并以其所在的单位区间方式表示。

2 结果和分析 2.1 不同类型愈伤组织的器官发生能力差异

通过诱导培养, 获得了3种类型的愈伤组织。第1类为光照条件下培养基中BA/NAA值为1时从无根试管苗基部诱导产生的茎基愈伤组织, 其表观特征为乳白色、絮状、疏松; 第2类为茎基愈伤组织在BA/NAA为0.5和黑暗条件下经过3次继代培养后获得的短继代愈伤组织, 其表现特征为灰白色、絮状、结构疏松; 第3类为长继代培养的愈伤组织, 即第2类愈伤组织再经过12次继代培养, 其表现特征为褐灰色, 絮状。将这3类愈伤组织进行器官发生诱导, 结果其器官发生能力表现出明显的不同。第1类愈伤组织, 在光下对其进行器官发生诱导, 30 d后不定芽发生频率为100 %。对其器官发生过程观察发现, 诱导7 d左右, 在愈伤组织的表层形成一些浅绿色团块状组织, 通过显微镜对其组织切片的观察发现, 团块状组织是一些排列规则、细胞较小、具有分裂活动中心的分生细胞团; 在随后的培养中, 分生组织细胞团颜色逐渐加深, 大约在25 d左右在分生组织细胞团块上形成了许多芽原基突起。然而, 第2和第3类愈伤组织经过30 d的器官发生诱导, 只在愈伤组织表层形成绿色团块, 很少有不定芽发生。进一步将形成的绿色团块取出重新培养在器官发生培养基上, 25 d后, 分别有87.1 %和50 %细胞团块形成了不定芽, 而其余只形成了结构致密、较硬的愈伤组织。

2.2 不同类型愈伤组织中蛋白差异

分别取处于旺盛分裂和生长期的上述3类愈伤组织进行SDS-PAGE分析, 结果见图 1、图 2。

从图 1和2可以明显地看出, 具有较强器官发生能力的茎基愈伤组织, 其蛋白条带明显地少于经过继代增殖培养的愈伤组织。经过继代培养的愈伤组织, 明显出现了4个新的蛋白条带, 它们是58.6 kDa、31 kDa、24.5 kDa和19 kDa。而且继代时期长短不同的愈伤组织在蛋白组分上也表现出了差异, 长继代愈伤组织出现40.6 kDa新蛋白带, 而且19 kDa蛋白带的蛋白含量明显增加。短继代愈伤组织89 kDa蛋白带的蛋白含量明显增加。

取茎基愈伤组织和长继代愈伤组织进一步进行IEF/2D分析, 结果见图 3和图 4。

对图 3和图 4中明显的蛋白点进行综合分析, 并结合器官发生电泳结果(图 5和图 6), 可得到以下结论:茎基愈伤组织蛋白点数明显少于长继代愈伤组织的; 茎基愈伤组织以1号和7号蛋白为特征蛋白, 长继代愈伤组织以7个蛋白即2、6、7、4、5、8、9号蛋白为特征蛋白。

2.3 愈伤组织器官发生过程中的蛋白变化

根据胡杨愈伤组织器官发生的特点, 将器官发生分为3个阶段, 即茎基愈伤组织阶段、分生细胞团阶段和不定芽产生阶段。分别取处于3个阶段的组织(即茎基愈伤组织、分生细胞团及带芽原基的组织)进行SDS-PAGE分析, 结果见图 1和图 2。

由图 1和图 2可知, 茎基愈伤组织蛋白条带明显少于分生细胞团和带芽原基的组织, 而且分生细胞团的蛋白条带略多于带芽原基的组织, 这可能与分生细胞团为分化细胞和未分化细胞共存有关。愈伤组织分化产生的分生细胞团和带芽原基的组织明显地出现了4个蛋白带, 它们分子量分别为55 kDa、31.6 kDa、19 kDa和20 kDa, 并且随着分生组织细胞团分化出不定芽原基, 34 kDa蛋白带变成分子量为33和35 kDa两个蛋白带。

进一步对3个阶段的组织进行IEF 2D分析, 结果见图 4、5和6。

对图 4、5和6中明显的蛋白点进行综合分析, 并结合图 3可以得到以下结果:分生细胞团和带芽原基的组织明显地表达了5个特征蛋白, 它们分别是0、4、5、8和9号蛋白, 其中最为突出的是0号蛋白, 其分子量为20 kDa, pI为5.5 ~ 6.5。带芽原基的组织在此基础上还有6、10和12号3个特征蛋白。另外, 分生细胞团也出现了1号和7号蛋白。

3 讨论 3.1 愈伤组织的表达蛋白与其器官发生能力间关系

无论从SDS-PAGE或IEF/2D的结果均可发现:在光照条件下和BA、NAA为0.5 mg·L^-1时诱导产生的具有较强器官发生能力的茎基愈伤组织, 有较少的蛋白条带和蛋白点, 随着茎基愈伤组织继代增殖培养或诱导分化, 蛋白条带数或点数增多。众所周知, 蛋白是基因表达的产物, 蛋白的增加表明了有新基因的转录和翻译, 而新基因的转录和翻译又与细胞的组织化或者细胞的分化相关。本试验结果清楚地表明经过较长时期继代增殖培养的胡杨茎基愈伤组织明显地表达了与器官发生相关的31 kDa和19 kDa蛋白带(图 3、2)和0、4、5、6、8和9号蛋白(图 4、5和6), 因而愈伤组织中表达蛋白的多少可反映其组织化和分化的程度, 其表达的蛋白少, 表明该愈伤组织的分化或组织化程度低, 具有较强的分生能力或器官发生能力。所以我们认为愈伤组织中蛋白种类的多少可作为判断其器官发生能力强弱重要的参考指标。但这一结果是否具有普遍性, 还有待于在其它植物上进行研究证实。

3.2 不同类型愈伤组织的蛋白分子标记

经过继代培养的茎基愈伤组织明显地表达了4个蛋白条带, 其中两个蛋白19 kDa和31 kDa(图 1、2)与器官发生中出现的蛋白一致, 故这两个蛋白可能与器官分化中细胞组织化相关, 而另两个蛋白带24.5 kDa、58.6 kDa为继代培养愈伤组织所特有, 因而可以作为继代培养的愈伤组织标记蛋白。

在IEF/2D分析中, 长继代培养愈伤组织出现了7个特征蛋白, 其中6、4、5、8、9号蛋白在器官发生中也产生, 7号蛋白在茎基愈伤组织和分生组织细胞团中均表达, 而只有3号蛋白为继代培养的愈伤组织明显表达的特征蛋白, 因而该蛋白可以作为继代增殖培养愈伤组织的标记蛋白。该蛋白分子量为47.8 kDa、pI为8 ~ 9。

长继代和短继代培养的愈伤组织表达的蛋白也存在着差异, 前者19 kDa蛋白带表达增强, 而后者89 kDa蛋白带表达增强, 因此两个蛋白带的表达强弱可以作为两类愈伤组织的分子标记。

通常, 人们对愈伤组织种类的划分仅根据诱导结果或表观形态来进行, 带有较大的局限性。通过蛋白差异来区分各类愈伤组织, 是从细胞发育的遗传控制角度在分子水平上对愈伤组织进行区别, 因而能更为有效和可靠。

3.3 愈伤组织器官发生的蛋白分子标记

蛋白作为植物发育的分子标记, 已开展了一些研究。例如Stafstrom(1988)将蛋白作为标记用于划分豌豆腋芽发育时期, Leshem(1990)和Villalobos(1984)分别发现了与香瓜(Cucumis melo)和针叶树离体子叶器官发生有关的蛋白标记。因而蛋白作为分子标记, 可以帮助我们深入认识隐藏在形态发育现象之下的细胞内部的生理生化及遗传物质变化, 进而了解植物发育的控制机制。

在胡杨愈伤组织器官发生过程中, 具有较强器官发生能力的茎基愈伤组织表现出两个特征蛋白即1号和7号, 其中1号蛋白在分生组织细胞团中也表达, 但在经过继代培养的愈伤组织和带芽原基的组织中没有表达, 该蛋白出现在器官发生前期, 因而可以看作器官发生前期的标记蛋白。该蛋白分子量为43 kDa, pI为6.5 ~ 7.5。7号蛋白由于也在继代愈伤组织和分生组织细胞团中表达, 故该蛋白可能与细胞增殖分裂有关。

分生细胞团和带芽原基的组织在单向电泳分析中表现出了4个特征蛋白条带, 其中20 kDa和55 kDa蛋白带为2者所特有, 因而该两个蛋白可以作为器官发生的标记蛋白。通过双向电泳进一步证实在20 kDa的蛋白带中含有特异的pI为5.5 ~ 6.5蛋白。

对带芽原基组织的电泳结果分析发现:它除了包括分生组织细胞团的一些特征蛋白外, 还出现了其特有的35和33 kDa蛋白带(图 1、2)。因而, 35和33 kDa蛋白带可以看作芽原基产生的标记。另外在双向电泳结果中虽然有一些特征蛋白出现如6、10、11和12号蛋白, 但由于它们均不是特有, 故还不能肯定其为带芽原基组织特有的标记蛋白。