游离氨基酸在植物抗病性中的作用, 近年来得到研究者的重视。据研究有的病害的抗性与某一氨基酸的含量有关, 有的病害的抗性与另一些氨基酸密切相关, 有的病害抗性与总氨基酸含量的有关, 真菌性病害与细菌性病害间的变化不同, 真菌性病害之间差异也很大(王金生等, 1990; 郭文硕等, 1992; Rudgard et al., 1985;Van, 1966)。有关栗树(Castanea spp.)对栗疫菌[ Cryphonectria parasitica (Murr.) Barr]的抗病性或感病性与游离氨基酸含量的关系国内外未见报道。本文拟以锥栗(Castanea henryi)不同抗病性的品种为材料, 研究接种栗疫菌后, 病害处于潜育期阶段寄主体内的各种游离氨基酸的动态变化。研究氨基酸在锥栗抗栗疫病中的作用, 探讨抗病机制, 以期找出其规律性变化, 指导抗病育种实践。

在福建省南平市福建农林大学西芹教学林场锥栗试验地上, 选取抗病品种小毛榛C₁₀ (感病指数15.1)、中抗品种薄壳子C₆ (感病指数25.1)、中感品种乌壳长芒C₅(感病指数38.7)和感病品种黄榛C₇(感病指数63.3)作为试验材料, 于1998-04中旬进行接种和取样。

在福建省建瓯市水源乡和龙村乡采集锥栗病枝干上的栗疫菌子座, 用0.1 %升汞溶液消毒2 ~ 3 min, 以无菌水漂洗2 ~ 3次后置PDA培养基上, 在25 ℃下培养, 得菌种纯化在试管斜面培养基上, 置4 ℃下保存。进行人工接种时, 将菌种挑取菌块置PDA mb(每升PDA加0.1 g蛋氨酸和0.001 g生物素)平板上25 ℃下培养5 d后, 用内径0.6 cm打孔器切下菌块备接种用。采集各锥栗品种3 a生直径约4 cm的枝条, 截成50 cm长, 上端以蜡封口, 水培在道格拉斯的孟加拉营养液中(硝酸钙0.16 g, 硫酸铵0.06 g, 磷酸二氢钾0.56 g, 硫酸镁0.25 g, 水1230mL), 每隔7 d换营养液1次。接种时用75 %酒精表面消毒枝条上的接种点, 并用无菌水擦洗2次。每枝选择3个接种点, 以卫生香烫伤接种点, 将定量菌丝块接入, 无菌湿棉球保湿3 d, 外面封以透明胶带, 以PDAmb作空白接种对照。每个锥栗品种接种15支枝条。

取接种点0 ~ 1 cm处的树皮。分别于接种前和接种后24h、72h、120 h和168 h各取样1次。

取5 g样品, 仔细研磨, 置三角瓶中, 加入20 mL 75 %乙醇, 置沸水浴上, 抽提20 min。过滤抽提物, 收集滤液于另一个三角瓶中, 重复上述抽提步骤3次。倒全部剩下的样品入分液漏斗并以10 mL的75 %乙醇洗涤。收集全部过滤液于一只三角瓶中, 然后在沸水浴上蒸发去除乙醇, 倒留在三角瓶里的水溶液于分液漏斗里, 加10 mL乙醚, 除去脂肪。移水层于三角瓶中, 用旋转式蒸发器使蒸发至糖浆状, 加入0.02mol·L^-1盐酸使成合适的体积, 于HITACHI_835—50型氨基酸分析仪测试。

以对照对实验结果进行校正。

从表 1可以看出, 同一品种接种前后, 随着时间的推移, 游离氨基酸含量的变化情况。抗病品种小毛榛(C₁₀)接种后的游离丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸以及总氨基酸都呈现规律性的变化, 即随着潜育期的发展, 含量逐渐降低, 到168 h时降到最低点; 中抗品种薄壳子(C₆)接种后的游离天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸以及总氨基酸的变化趋势也是接种后含量逐渐降低, 至168 h降至最低点; 中感品种(C₅)的游离谷氨酸接种后逐渐升高, 至168 h时达到最高, 其他的氨基酸含量都不呈规律性变化, 总氨基酸含量接种后于72 h降至最低点, 72 h后反而开始升高; 感病品种黄榛(C₇)接种后脯氨酸含量逐渐升高, 而总氨基酸含量的变化与中感品种一样, 接种后先降低, 至72 h后反而升高。

表 1 不同抗病性锥栗游离氨基酸含量^① Tab.1 The contents of the free amino acid from Castanea henryi with different resistance

表 1 不同抗病性锥栗游离氨基酸含量① Tab.1 The contents of the free amino acid from Castanea henryi with different resistance

从图 1可见, 在接种前的健康组织中, 总氨基酸含量与锥栗的抗病性或感病性不存在相关性。接种后24 h和72 h, 抗病品种中抗品种总氨基酸的含量比中感品种、感病品种高, 接种后120 h和168 h, 感病品种、中感品种比中抗品种、抗病品种高。

图 1 锥栗抗病性与总游离氨基酸含量的关系 Fig. 1 The relation between the resistance of Castanea henryi and the total content of free amino acid —◆—接种前Before inoculation; —■—接种后24 h after inoculation; —▲—接种后72 h after inoculation; —×—接种后120 h after inoculation; —*—接种后168 h after inoculation.

从图 2可见, 接种前的健康组织中, 游离丙氨酸、胱氨酸含量与品种的感病性呈正相关, 游离苯丙氨酸含量与品种的抗病性呈正相关; 接种后各种游离氨基酸呈规律性变化的是在168 h时, 游离脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和胱氨酸含量与品种的抗病性呈负相关; 从图 2也可看出, 接种前和接种后168 h的游离丙氨酸和胱氨酸含量都与品种的抗病性呈负相关。

图 2 锥栗抗病性与部分氨基酸含量的关系 Fig. 2 The relation between the resistance of Castanea henryi and the content of some free amino acids —◆—接种前丙氨酸Alanine before inoculation; —■—接种前胱氨酸Cystine before inoculation; —▲—接种后168 h脯氨酸Proline at 168 h; —×—接种后168 h谷氨酸Glutamate at 168 h; —*—接种前苯丙氨酸Phenylalanine before inoculation; —●—接种后168 h丝氨酸Serine at 168 h; —|—接种后168 h甘氨酸Glycine at 168 h; —□—接种后168 h丙氨酸Alanine at 168 h; —○—接种后168 h胱氨酸Cystine at 168 h.

关于游离氨基酸与植物病害的关系, 讨论较多的是感病组织中氨基酸含量的变化(Patel et al., 1963), 也有人注意到, 某些特殊氨基酸的含量变化会影响寄主的抗感表现(Kuc et al., 1959), 杨树对溃疡病菌[ Hypoxylon mammatum (Wahl.)Mill]侵染的反应是体内脯氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺含量的增加与发病率呈正相关, 这些氨基酸被认为可刺激病原菌的生长(叶建仁, 1996)。在水稻对白叶枯病[ Xanthomonas oryzae (Ishyama)pv.Oryzae]的抗性研究认为, 抗病品种中游离氨基酸含量少(方中达, 1963)。而王爱民等在研究萝卜对芜菁花叶病毒的抗性和其叶内游离氨基酸含量的关系时, 发现抗病品种叶内含有较高的蛋氨酸, 感病品种的含量较低, 子叶期后, 萝卜叶内天冬氨酸、蛋氨酸、脯氨酸及总游离氨基酸含量的迅速提高和抗病性的迅速增强呈平行关系, 病叶蛋氨酸、酪氨酸含量和健叶差异不明显, 其他各种氨基酸含量均有不同程度的上升(王爱民等, 1991)。

本研究发现, 栗疫菌侵染不同抗性的锥栗品种后, 在潜育期中不同阶段, 其游离氨基酸含量的变化是不同的, 说明进行游离氨基酸在抗病性中的作用的研究时, 须注意采样时间的确定, 不同的采样时间有不同的结果。本研究表明, 受到栗疫病菌侵染后, 不论是抗病品种还是感病品种总游离氨基酸含量都减少, 这与研究汤菜白粉病(Erysiphe cruciferarum)中游离氨基酸的变化相类似(Rudgard et al., 1985)。这可能是由于组织中的游离氨基酸被病原菌作为营养利用有关; 感病品种在潜育期的后期, 总游离氨基酸含量反而上升, 这可能存在着寄主与病原的亲和性识别。本研究中, 在锥栗健康组织中和接种后168 h其游离丙氨酸和胱氨酸含量的变化趋势一致, 不受取样时间的影响, 都与品种的抗病性呈负相关。

值得注意的是, 一般植物在遭受环境的胁迫时, 普遍会产生游离脯氨酸的积累(汤章城, 1984)。朱玮等(1997)在研究杨树溃疡病(Dothiorella gregaria)时, 用病原菌的代谢产物作用于寄主, 发现高度感病的北京杨, 其脯氨酸含量在48h、72h后与对照相比分别增加108.3 %、46.4 %, 而高度抗病的毛白杨脯氨酸含量与对照比无明显差异, 说明脯氨酸与抗感病性密切相关。本研究中, 只有感病品种黄榛在接种后产生游离脯氨酸逐渐升高的现象, 其他品种游离脯氨酸含量接种后甚至比接种前的健康组织低。可见, 游离脯氨酸在抗感机制上的作用, 在不同病害虫具有相类似的结果, 可作为植物抗病性测定中重要生化指标。