桦木属(Betula)在我国约有30种, 主要分布于东北、华北、华中、西南以及西北等广大地区。其中能被开发利用的乔木有23种, 这些树种的生长特性、抗性及木材物理性质差异很大, 每一树种各有其优缺点(中国植物志第十一卷, 1979)。如果开展杂交育种研究, 可以综合两个或多个树种的优良特性。由于种间杂交更容易发生在亲缘关系较近的种间, 为此, 对桦树种间亲缘关系的分析, 是进行种间杂交的前提(王明庥, 1988)。本文应用RAPD技术, 在DNA水平上鉴定几种桦树的亲缘关系, 为开展种间杂交亲本的选配, 充分挖掘基因资源提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

欧洲白桦(B.pendula) (由芬兰林木育种基金会提供)、枫桦(B.costata)、赛黑桦(B.schmidtii)、白桦(B.platyphylla)的种子, 于1998—05播种于塑料大棚中, 6月中旬采集幼叶(-70 ℃冰箱中保存备用。黑桦(B.davurica.)、柴桦(B. fruticosal)试材于1998年早春分别采自哈尔滨市植物园(表 1)。

1.2 总DNA提取与浓度的测定

CTAB法提取总DNA, 利用美国PERKIN ELMER公司生产的UV/V1S Spectrometer Lambda Bio 10测定所提DNA的含量和纯度。

1.3 引物筛选

参阅国内外有关研究文献, 参照Operon公司的引物序列, 在TaKaRa公司合成了75个10碱基长度的寡核苷酸引物, 分别扩增桦树2个DNA样品, 筛选出扩增性强、重复性好、多态性高的14个引物(表 2), 用于全部桦树DNA样品的扩增。

1.4 PCR扩增及产物的鉴定

RAPDPCR扩增是在Perkin-Elmer 9600扩增仪上进行, 每20 μL反应体积中含40 ng DNA模板, 30 ng引物, 0.2 mmol/L 4× dNTP(Sangon产品), 1×缓冲液, 1U TaqDNA聚合酶(Promega产品)。扩增程序为:94 ℃加热3min, 使模板DNA变性, 然后进入下列温度循环:94 ℃变性1 min、37 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min, 共计40个循环。循环结束后在72 ℃延伸7 min, 以保证DNA延伸彻底。

PCR扩增反应结束后, 采用1×TAE电泳缓冲液, 在1.5 %的琼脂糖凝胶中(含EB 0.5 μg·mL^-1)电泳分离扩增产物, 同时, 在适当的位置上加上一个已知分子量的DNA标准样品(100bp DNA Ladder购自MBI公司), 电泳结束后在UVP凝胶成像系统下观察照相。

1.5 数据统计与分析

电泳图谱中的每一条带均代表了引物与模板DNA互补的一对结合位点, 可记为一个分子标记, 根据分子量标准对照反应产物在胶上的对应位置, 估计扩增产物的分子量大小, 有带的记为1, 无带的记为0, 形成0 1矩阵图输入计算机。

采用RAPDistance软件包, 用Excoffier et al.(1992)遗传距离公式计算个体间的遗传距离, 用Neighbor —Joining方法构建个体间树状聚类图。与AMOVA分析软件连用, 计算种间的遗传距离, 应用STATISTICA分析软件, 构建了供试桦树的亲缘关系聚类图。

2 结果与分析 2.1 多态位点比率

多态位点百分率可作为度量遗传变异水平高低的指标, 对6种桦树48个个体进行了RAPD分析。共检测到233个位点, 位点范围在250 ~ 2000bp之间(图 1、2), 多态位点百分率在12.02 %~ 36.91 %之间, 多态位点比率由大到小依次为枫桦、欧洲白桦、白桦、赛黑桦、黑桦和柴桦(表 3), 结果表明:枫桦的遗传变异水平最高, 柴桦的遗传变异水平较低。

2.2 遗传距离聚类分析

利用AMOVA软件分析了桦树的RAPD扩增数据, 得到种间的遗传距离矩阵(表 4), 将遗传距离矩阵输入STATISTICA软件分析, 构建了供试桦树的亲缘关系聚类图(图 3), 结果显示:在1.22的遗传距离上6种桦树分为两大类群, 即柴桦单独为1类, 其它聚为1类。第二类群中, 在1.20的遗传距离上又分为两个亚群, 即黑桦、欧洲白桦、白桦聚为1亚群, 赛黑桦和枫桦聚为另1亚群。

3 讨论 3.1 桦树遗传变异的分析

桦树在我国的分布极广泛, 遍布十几个省区。由于桦树分布区内气候和地理条件的多样性造成了种间遗传变异的复杂性。在所分析的几种桦树中枫桦是桦树中最耐阴者(周以良, 1994), 其遗传变异水平最高, 因而具有较大的选择潜力, 对这一基因资源需要充分挖掘、合理利用。

3.2 几种桦树种间亲缘关系的比较

经典的分类方法将桦木属分为西桦组(Sect. Betulaster)和桦木组(Sect. Betula), 本实验分析的桦树均属于桦木组(郑万钧, 1985), 应用RAPD标记技术对几种桦树亲缘关系的分析结果与传统的形态分类结果基本一致, 只是枫桦和赛黑桦在经典分类中亲缘关系较远, 而利用RAPD技术分析则亲缘关系很近。

3.3 开展桦树种间杂交的建议

研究表明, 杂交更容易发生在亲缘关系较近的种间。本实验利用RAPD分子标记技术对几种桦树亲缘关系的分析结果是, 亲缘关系较近的有2组, 即黑桦、欧洲白桦与白桦组, 赛黑桦与枫桦组。在杂交育种研究中建议首先选定这2组进行杂交可配性试验, 进行桦树种间杂交尝试, 同时应考虑亲本双方的优缺点能互补, 亲本的优良性状要突出, 才有希望达到育种目标。