鹅掌楸属(Liriodendron)种间杂种在生长和适应性上表现出强大的杂种优势, 因而已广泛应用于生产实践(王章荣, 1997)。根据鹅掌楸的生物学特性(尹增芳等, 1995), 从叶培忠教授早期的杂交工作开始, 生产上一直沿用不套袋授粉技术, 虽然理论分析证明这种授粉技术的花粉污染率在1 %以下(Houston et al., 1989; 李周岐等, 2000), 但缺乏直接的检测证据, 而要对这种杂交后代进行父系鉴定首先必须找到一种合适的父系标记。随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA, RAPD)分子标记技术自从1990年(Williams et al., 1990)产生以来, 因其在操作上的快速简便性而广泛应用于生命科学的许多领域(卢江, 1993; 邹喻萍, 1995), 在林木上, RAPD标记已成功的用于遗传连锁图谱构建(甘四明等, 1998)、谱系分析(Nesbitt et al., 1997)和花粉流标记(黄双全等, 1998)等方面。虽然RAPD标记是一种显性标记, 但通过分析双亲标记谱带的多态性及在子代中的分离情况, 有可能找出一些父本特征谱带从而用于父系鉴定。本文以鹅掌楸属1个种间全同胞杂种家系及其2个亲本植株为材料, 分析了RAPD标记在鹅掌楸中的遗传模式, 为利用RAPD标记进行父系鉴定和遗传作图提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

分别以1株中国马褂木(L. chinense (Hemsl.)Sarg.)和1株北美鹅掌楸(L. tulipifera L.)为母本和父本, 于1999年花期进行控制杂交, 杂交种子于1999-11进行培养箱发芽, 种子发芽并生长1周后对18个植株整株取样。同期, 从两个亲本植株上各采集休眠芽2枚用于DNA提取。

1.2 DNA提取和RAPD反应

对各子代幼苗和除去外层芽鳞的各亲本休眠芽参考Doyle的方法(Doyle et al., 1990)提取总DNA。提取液中加入5 %的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和2 %的β-巯基乙醇。提取的DNA用含EB(溴化乙锭)的琼脂糖凝胶电泳检测浓度。随机选取Operon公司的280个随机引物, 用2个亲本植株的DNA样品进行PCR扩增, 初筛和复筛出14个能产生多态性、清晰和明亮谱带的引物(表 1)用于正式扩增。RAPD扩增在PE9600上进行。反应采用20 μL体系:10倍反应缓冲液2μL(100 mmol Ph8.3 Tris-HCl, 500 mmol KCl, 20 mmol MgCl₂, 0.01 %明胶, 5g·L^-1 BSA), Taq聚合酶1 u, dATP、dTTP、dCTP和dGTP各250μmol, 引物5 pmol, DNA模板50 ng左右。扩增程序为94 ℃预变性2 min; 随后94 ℃30 s, 40 ℃30 s, 72 ℃1.5 min, 38个循环; 72 ℃延伸7 min后转入4 ℃保存。扩增产物用含有溴化乙锭的1.0 %琼脂糖凝胶在1 ×TBE缓冲液中电泳分离, 最后在紫外灯下用MP4 +Polaroid摄像系统照相记录结果。

1.3 RAPD位点的遗传分析

RAPD谱带用“0”代表无、“1”代表有进行统计。每条谱带名称包括引物名、谱带长度和强度。谱带强度分为3个等级, 1级为最强。假设RAPD标记为1对等位基因按显性方式遗传, 则具有某条谱带的亲本在该位点上的基因型为AA或Aa, 而无该谱带的亲本为aa, 由此推断该谱带在子代中的理论分离。用χ²进行适合度检验, α取0.05。

2 结果与分析 2.1 RAPD扩增结果

14个引物共扩增出57条谱带, 扩增片断的长度介于2.51 kb (引物OPQ19)~ 330 bp(引物OPAT09)之间。表 1列出了不同引物扩增的总谱带数、谱带在双亲间的多态性及其在子代中的分离情况。可见57条谱带中, 在双亲中均有且在子代中不分离的谱带25条(43.86 %)、在子代中分离的谱带12条(21.05 %), 在双亲间呈多态性且在子代中不分离的谱带4条(7.02 %)、在子代中分离的谱带16条(28.07 %)。共有20条(35.09 %)谱带在双亲间呈多态性、28条(49.12 %)谱带在子代中分离。就杂合性而言, 母本总谱带数41条, 杂合(分离)谱带数16条, 杂合度约28.07 %; 父本总谱带数53条, 杂合(分离)谱带数24条, 杂合度约42.11 %。可见, 父母本的杂合度均偏低, 而且父母本间遗传差异较小。其中4条在双亲间呈多态性且在子代中不分离的谱带(OPAU16-1400/3, OPAT09-330/1, OPK09-600/1, OPQ17-2500/3)均为父本所有, 以1-(1/2)18的可靠性可以认为这4个位点为纯合位点(基因型为AA), 因此可作为父本标记用于父系鉴定。图 1 (上)显示不分离位点OPAT09-330/1。

2.2 RAPD分离标记的适合度检验

假设RAPD标记为1对等位基因按显性方式遗传, 对28个分离位点作χ²检验(表 2)。可以看出, 为双亲所共有的12个分离位点均未显著偏离3:1的理论比例, 在双亲间呈多态性的16个分离位点中, 除2个(OPS07-1000/3, OPZ05-480/2)外, 其余14个的分离比例均未显著偏离1:1的理论比例。偏分离标记占分离标记总数的7.14 %, 与在杨树(Bradshaw et al., 1994)上的研究结果相比偏分离位点比率较低, 这种偏分离现象可能与子代群体偏小、非等位位点的共带现象、配子选择和隐性纯合致死等位基因的存在等因素有关(Carlson et al., 1991; Virk et al., 1998; Sniezko et al., 1988; Lanham, 1996)。因此, 可以按RAPD标记为一对等位基因按显性方式遗传的假设对鹅掌楸属进行父系鉴定或采用“拟测交“策略进行遗传作图。图 1 (下)显示位点OPAO12-600/1的1:1分离。

3 讨论 3.1 用RAPD标记进行父系鉴定

由于RAPD标记是一种显性标记, 所以不太适宜用作父系鉴定, 但如果能找出一些父本特有谱带(在母本中无)的纯合位点(在子代中不分离), 同时能证明这些谱带在群体中出现的频率较低或同时具有这些谱带的个体在群体中所占的频率较低, 则可用于父系鉴定。在本试验中, 为父本所特有的4条谱带(OPAU16-1400/3, OPAT09-330/1, OPK09-600/1, OPQ17-2500/3)在18个子代中未出现分离现象, 以1-(1/2)¹⁸的可靠性可以认为这4个位点为纯合位点(基因型为AA), 通过进一步分析这4条谱带或谱带组合在群体中出现的频率, 有可能作为父本标记用于父系鉴定。

3.2 父母本的杂合度及遗传多态性

由于无法确定那些在双亲中均有且在子代中不分离位点在父本和母本中的基因型(AA或Aa), 所以不能确切确定亲本的杂合度, 但从分离位点数占总位点数的比例可以大概推知, 母本(中国马褂木)杂合度约为28.07 %、父本(北美鹅掌楸)杂合度约为42.11 %。虽然本试验仅包括1株北美鹅掌楸和1株中国马褂木, 但这在一定程度上反映了北美鹅掌楸的杂合度远高于中国马褂木, 这与Parks(Parks et al., 1990)等用同工酶标记进行遗传多样性研究的结果一致。中国马褂木杂合度较低可能是由于其自然居群较小(朱晓琴等, 1997), 在长期的交配过程中存在一定程度的近交, 从而导致杂合度下降、纯合位点增多。杂合度低也可能是该树种濒危的原因之一。从遗传多态性来看, 所检测的57条谱带中有20条谱带在双亲间呈多态性, 多态位点占35.09 %, 可见中国马褂木与北美鹅掌楸遗传分化较小。

3.3 鹅掌楸中RAPD位点的分离和遗传

在本研究中, 子代的所有谱带均可在亲本中找到, 亲本的所有谱带也均在子代中出现, 表明RAPD位点具有可靠的遗传性。在28条分离谱带中, 有26条服从孟德尔1对等位基因的遗传规律, 偏分离位点仅占7.14 %, 说明可采用“拟测交”策略进行鹅掌楸遗传图谱构建, 由于平均每个引物仅能检出1.14个“拟测交”位点, 所以将需要用较多数目的引物进行扩增。