在昆虫与植物的相互作用关系中, 次生代谢物质被看作是植物对昆虫的化学防御机制之一。然而, 植食性昆虫能够在寄主植物上完成生长发育过程, 其重要原因就在于虫体自身具有相应的对寄主植物次生代谢物质的代谢适应能力(钦俊德, 1995; 1987)。昆虫对待寄主植物中有毒的次生代谢物质可通过羧酸酯酶(E.C.3.1.1.2)、谷胱甘肽转移酶(E.C.2.5.1.18)、多功能氧化酶(E.C.1.14.14.1)等解毒酶(Dauterman et al., 1988), 将其转化为非毒性物质, 从而使昆虫能够适应取食对象。在烟草夜蛾(Heliothis virscens)(Riskallah et al., 1986)、虎凤蝶(Papilio glaucus glaucus)(Lindroth, 1989)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)(谭维嘉等, 1990)、小菜蛾(Phitella xylostella)(李云寿等, 1996)、棉蚜(Aphis gossypii)(高希武, 1992)等昆虫中均已证实, 当取食不同寄主植物时, 昆虫的解毒酶活性会发生明显改变。这种改变通常被认为是由于次生代谢物质的诱导作用导致的。

我国主要的杨树栽培区受光肩星天牛[ Anoplophora glabripennis(Motsch.)]危害十分严重。前人曾在光肩星天牛的分布、寄主、形态、生活史、习性、防治技术等方面进行了深入细致的研究(秦锡祥等, 1985; 贺萍等, 1993), 取得了显著的成就。随着研究的深入, 特别是抗虫育种研究受到重视, 已经有一些研究涉及到树木无机元素、营养成分、次生代谢物质与抗虫的关系(杨雪彦等, 1992; 王克胜等, 1995; 王蕤等, 1995; 孙丽艳等, 1995; 黄大庄等, 1996)。这些研究基本都是依据树木被害率与化学成分含量差异判断树木抗虫性的, 不能确认存在差异的化学成分会对虫体生理代谢产生怎样的影响。从光肩星天牛生理生化角度进行研究, 并通过数理统计分析方法进一步探讨光肩星天牛生理代谢因素(解毒酶)与光肩星天牛取食对象因素(次生代谢物质)的相关性, 这在国内外未见报道。本文将此方面的研究结果报道如下, 供杨树抗光肩星天牛育种等有关方面研究参考。

1 材料与方法 1.1 杨树的选用

选用以下杨树作为光肩星天牛幼虫的取食对象:毛白杨(Populous tomentosa)、新疆杨(P.alba var.pyramidalis)、I-214杨(P.×euramericana cv.“I-214”)、加拿大杨(P.canadensis)、山海关杨(P.canadensis cv.“Shanhaiguanensis”)、北京杨(P.×beijingensis)、J-1杨^*、J-2杨^*(*为正在选育的品种)。

1.2 光肩星天牛的饲养

田间捕捉成虫, 放入养虫笼内, 以北京杨枝条饲养。成虫交配并产卵于枝条内, 每日更换枝条, 从中剖取当日虫卵, 放在培养皿中并保持一定湿度(底部垫湿润脱脂棉, 上衬一层滤纸, 虫卵置于滤纸上面)。在孵化当日, 将幼虫分别接种于以上8种杨树2年生枝条皮下, 使孵化后未进食的幼虫仅取食所接种的杨树, 以见排粪确认其取食并存活, 10日后从枝条内剖取幼虫, 用于测定解毒酶活力。

1.3 光肩星天牛幼虫解毒酶活力的测定

酶源制备  光肩星天牛幼虫5头每组, 加水2.5 mL, 冰浴下匀浆。4 ℃, 10000 r·min^-1, 离心30 min, 取上清液作为酶源。取食8种杨树的幼虫各制备3份样品作为3次重复。

酶源蛋白质含量测定  反应体系为1头·mL^-1酶源0.4 mL, 水2.6mL, 0.02 %考马斯亮兰G₂₅₀(CBB-G₂₅₀)3.0 mL, 总体积6 mL。分光光度计测595nm处光密度值, 重复3次, 根据蛋白质标准曲线方程求酶源蛋白质含量。

羧酸酯酶酶活力测定反应体系为0.04 mol·L^-1 pH7.0磷酸缓冲液0.7 mL, 0.0003mol·L醋酸-α-萘酯底物液(含0.0001 mol·L^-1水杨酸毒扁豆碱)5mL, 0.1头·mL^-1酶源0.3 mL, 总体积6 mL。在37 ℃水浴中震荡30 min, 加入坚牢蓝B显色剂1 mL, 25 ℃恒温放置30 min, 分光光度计测600 nm处光密度值。根据α-萘酚(α-NA)标准曲线方程求出酶促生成的α-萘酚量, 酶的比活力表达为α-NAmmol·L^-1(mg pr)^-1(30 min)^-1。使用SAS统计分析软件对酶的比活力进行方差分析。

谷胱甘肽S-转移酶活力测定反应体系为0.066 mol·L^-1 pH7.0磷酸缓冲液(含0.002 mol·L^-1乙二胺四乙酸)2.5 mL, 0.05mol·L^-1还原型谷胱甘肽底物液0.3 mL, 0.03 mol·L^-1 2, 4-二硝基氯苯丙酮底物液0.1 mL, 1头·mL^-1酶源0.1mL, 总体积3 mL。25 ℃下分光光度计测反应5 min的340 nm处光密度值。酶的比活力表达为OD值·(mg pr)^-1(5 min)^-1。使用SAS统计分析软件对酶的比活力进行方差分析。

1.4 杨树次生代谢物质分析

杨树次生代谢物质种类  酚类:苯酚、邻苯二酚等; 酚酸类:苯甲酸、水杨酸、对羟基苯甲酸、儿茶酸、没食子酸、丁香酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、绿原酸等; 甙类:水杨甙。

样品制备  取8种杨树2年生枝条, 剥取韧皮部, 剪碎并烘干, 粉碎后过40目筛, 120 ℃烘至恒重。

酚类:干粉2.0000 g加50 mL石油醚, 超声波振荡2 h, 放置过夜, 滤去石油醚。将残渣晾干, 加40 %甲醇50 mL, 加热回流2 h, 过滤, 滤液用甲醇定容至50 mL, 摇匀, 经0.5 μm滤膜过滤, 清液待测定。

酚酸类:干粉3.0000 g加50mL石油醚, 超声波振荡30 min, 放置过夜, 滤去石油醚。将残渣晾干, 加50 %甲醇50mL, 加热回流1 h, 过滤, 滤液浓缩定容至25mL。取Waters公司Sep-pak C18小柱1支, 用5 mL甲醇冲洗活化, 再用5 mL水冲洗。吸取5 mL样品提取液通过小柱, 弃去最初洗出液1 mL, 再收集2 mL洗出液待测定。

水杨甙:干粉5.0000 g加30 mL乙醚过夜脱脂。滤去乙醚, 残渣中加50 %甲醇50 mL, 加热回流1 h, 过滤, 滤液中加10 %醋酸铅10 mL, 摇动2 min, 滤去沉淀物, 滤液浓缩至干, 用甲醇重新溶解并定容至50 mL, 摇匀, 经0.5 μm滤膜过滤, 清液待测定。

次生代谢物质含量测定采用高效液相色谱分析法, 仪器为Waters 244型HPLC, Kromasil C18柱(0.4 cm×15 cm)。定量方法采用外标法(峰高)定量, 洗脱速度0.7 mL·min^-1。

色谱条件:

① 苯酚、苯甲酸、水杨酸、肉桂酸:

流动相: 65 %甲醇, 35 %水, 0.1 %磷酸调pH =4

检测器: UV 232nm×0.1 AUFS

② 邻苯二酚、对羟基苯甲酸、儿茶酸、没食子酸、丁香酸、香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、绿原酸:

流动相: 30 %甲醇, 70 %水, 0.1 %磷酸调pH =4

检测器: UV 254nm×0.1 AUFS

③ 水杨甙:

流动相: 40 %甲醇, 60 %水, 0.1 %磷酸调pH =4

检测器: UV 254nm×0.1 AUFS

标样和试剂  苯酚、邻苯二酚、苯甲酸、水杨酸、对羟基苯甲酸、儿茶酸、没食子酸、丁香酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、绿原酸:色谱纯(Sigma公司)。

水杨甙:分析纯(北京化工厂)

水:重蒸, 并经0.45μm滤膜过滤

甲醇:优级纯, 并经0.5μm滤膜过滤

磷酸:优级纯

石油醚、乙醚、乙醇、醋酸铅:分析纯

1.5 酶活力与次生代谢物质逐步回归分析

使用SAS统计分析软件对酶的比活力与杨树次生代谢物质进行逐步回归分析。

2 结果 2.1 羧酸酯酶活力测定结果

羧酸酯酶比活力的大小顺序为加拿大杨>新疆杨>北京杨>J-2杨>I- 214杨>毛白杨>山海关杨>J-1杨。方差分析表明, 取食不同杨树的光肩星天牛幼虫羧酸酯酶活力存在显著差异。多重比较见表 1。

2.2 谷胱甘肽S-转移酶活力测定结果

谷胱甘肽S-转移酶比活力的大小顺序为新疆杨>毛白杨>I- 214杨>加拿大杨>山海关杨>J-2杨>J-1杨>北京杨。方差分析表明, 取食不同杨树的光肩星天牛幼虫谷胱甘肽S-转移酶活力存在显著差异。多重比较见表 2。

2.3 杨树次生代谢物质分析结果

8种杨树枝条韧皮部次生代谢物质含量测定结果见表 3。

2.4 羧酸酯酶活力与次生代谢物质逐步回归分析结果

羧酸酯酶与次生代谢物质逐步回归分析表明, 有苯甲酸(x₃)、邻苯二酚(x₂)、儿茶酸(x₆)3种次生代谢物质进入逐步回归方程。其中苯甲酸(x₃)是毛白杨、新疆杨、I-214杨所缺少的种类; 邻苯二酚(x₂)是加拿大杨、I-214杨、山海关杨、北京杨所缺少的种类; 儿茶酸(x₆)是J-2杨所缺少的种类。羧酸酯酶与次生代谢物质逐步回归方程: y =13.7339 +0.0095x₂ -0.0159 x₃ -0.0971x₆

2.5 谷胱甘肽S-转移酶活力与次生代谢物质逐步回归分析结果

谷胱甘肽S-转移酶与次生代谢物质逐步回归分析表明, 有苯酚(x₁)、香豆酸(x₁₀)、对羟基苯甲酸(x₅)、丁香酸(x₈)、水杨酸(x₄)、水杨甙(x₁₄)6种次生代谢物质进入逐步回归方程。其中苯酚(x₁)是北京杨所缺少的种类; 丁香酸(x₈)是毛白杨、山海关杨、北京杨所缺少的种类; 谷胱甘肽S-转移酶与次生代谢物质逐步回归方程: y =0.8942 + 0.0052x₁ +0.0003 x₄ -0.0068x₅ +0.0141x₈ +0.0212x₁₀ +0.030x₁₄

3 结论与讨论

对鳞翅目烟草夜蛾、虎凤蝶、棉铃虫、小菜蛾等以及同翅目棉蚜等昆虫(Riskallah et al., 1986; Lindroth, 1989; 谭维嘉等, 1990; 高希武, 1992; 李云寿等, 1996)的研究表明, 取食不同植物种类可诱导昆虫体内解毒酶活力发生改变。本研究对取食不同杨树的鞘翅目光肩星天牛幼虫羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶活力的测定, 得到相同的结论。

进一步分析诱导解毒酶活力改变的取食因素, 对了解二者之间的相互作用关系和分析取食因素对光肩星天牛的化学防御机制具有重要意义。高希武等(1997)和董向丽等(1998)采用人工饲料方法, 证实芸香甙等3种植物次生代谢物质可诱导棉铃虫谷胱甘肽S-转移酶活力明显增高。本研究通过逐步回归分析, 确认有3种次生代谢物质对羧酸酯酶有显著影响, 有6种次生代谢物质对谷胱甘肽S-转移酶有显著影响。从逐步回归方程可以看到, 如果杨树邻苯二酚含量增高, 苯甲酸、儿茶酸含量降低, 则羧酸酯酶活力较高; 如果杨树苯酚、香豆酸、丁香酸、水杨酸、水杨甙含量增高, 对羟基苯甲酸含量降低, 则谷胱甘肽S-转移酶活力较高。

植物的生理生化反应是异常复杂的, 不同植物在不同环境下有不同的反应, 而且植物与昆虫二者之间又是不断相互选择、协同进化的(李镇宇等, 1998)。在寄主植物与昆虫解毒酶关系方面的研究, 近些年还只是集中在羧酸酯酶、谷胱甘肽转移酶、多功能氧化酶上(谭维嘉等, 1990; 高希武, 1992; 李云寿等, 1996; 张文吉等, 1996; 张友军等, 1997; 高希武等, 1997; 董向丽等, 1998), 应该看到昆虫取食对象对虫体生理代谢的影响必定是多方面或综合性的。本研究仅反映8种杨树的14种酚类、酚酸类和甙类与光肩星天牛2种解毒酶活力的相关性, 而实际上还会有诸如生物碱、萜烯类、非蛋白氨基酸等, 对解毒酶活力产生影响。逐步积累此类研究结果, 深入探讨杨树对光肩星天牛的化学防御机制, 全面考虑与虫体生理代谢有相关关系的次生代谢物质种类及其生理效应, 对选育抗光肩星天牛杨树品种和治理光肩星天牛将会有一定帮助。