蓝污真菌(Blue stain fungi)是指那些能把受在树木的木质部染成蓝色的真菌类群(叶辉, 1997a; Solheim et al., 1993)。而那些与小蠹虫生活史关系密切, 经由小蠹虫携带到寄主植物体内, 并对寄主植物产生一定致病作用的蓝污真菌常称为小蠹虫蓝污真菌或小蠹虫携带的蓝污真菌(blue stain fungi associated with bark beetles) (叶辉, 1997a; 1997b)。蓝污真菌也被认为是与小蠹虫共生的真菌类群(Whitney, 1982)。近10多年来对小蠹虫的深入研究发现, 蓝污真菌在小蠹虫侵害作用中发挥着十分重要的作用(叶辉, 1997a)。例如, 对于云杉八齿小蠹(Ips typographus), 蓝污真菌是其成功侵害的先决条件(叶辉, 1997a)。已证明, 与华山松大小蠹共生的蓝污真菌是致死华山松的主要原因, 也是该蠹虫成功定居和大量繁殖的必要条件(陈辉等, 2000)。探讨小蠹虫蓝污真菌已成为深入小蠹虫蛀害机理研究的重要方面。

纵坑切梢小蠹(Tomicus piniperda)是云南松的主要蛀食性害虫, 20世纪80年代以来已毁灭云南松林达10×10⁴ hm²以上, 对云南松的危害极大(刘明德等, 1992)。在欧洲, 纵坑切梢小蠹蓝污真菌主要有两种, 即:Leptographium wingfieldii和Ophiostoma minus (Solheim et al., 1993; 叶辉, 1997b; Solheim et al., 1991)。这两种蓝污真菌对苏格兰松危害性较大, 通过人工接种试验证明, 该菌可以直接导致苏格兰树死亡(Solheim et al., 1991; 1993)。近年来, 在探讨纵坑切梢小蠹对云南松林形成大面积危害的成因过程中(Ye, 1991;叶辉等, 1994; 叶辉, 1996; 1999), 我们也开始了对该虫蓝污真菌的研究, 在国内首次从纵坑切梢小蠹中分离出蓝污真菌两个种。一种为O.minus, 该种与在欧洲的属于同一个种(周旭东等, 1998); 另一种为在云南首次发现并定名的新种, 定名为L.yunnanense Zhou, Jacobs, Wingfield & Morelet. (Zhou et al., 2000)。

对纵坑切梢小蠹蓝污真菌的研究涉及到, 蓝污真菌的致病力、侵染力、蓝污真菌与纵坑切梢小蠹的协同作用关系, 以及寄主树木对蓝污真菌的抗性等内容。对该菌的研究将为全面认真纵坑切梢小蠹大范围危害的机理提供重要信息。本文为纵坑切梢小蠹蓝污真菌综合研究中的一部分, 旨在探索蓝污真菌(L. yunnanense)侵害云南松韧皮组织和木质部的解剖学证据。

1 材料和方法

野外工作于1997~1998年春在昆明附近的云南松林进行。从纵坑切梢小蠹及其坑道韧皮组织中分离出蓝污真菌(L.yunnanense), 用PDA培养基培养, 经两次纯化后。该菌已经证明与纵坑切梢小蠹生活史具有密切关系, 并被确认为是该小蠹虫的携带菌(周旭东等, 1998)。有关这方面的信息还将在另文中作深入报道。蓝污真菌的分离及接种的具体方法见“云南松蠹害枝梢虫坑真菌类群初步研究”一文(周旭东等, 1998)。将纯化后的蓝污真菌接种到云南松活树上。3个月后, 取下接种点附近的韧皮组织和接种点内的木质部组织作为观察、测试样品。该样品分为两部分。一部分放入消毒袋内带回, 在实验室内进行蓝污真菌的分离、培养、鉴定, 以确定该菌在寄主组织中存在。另一部分当即放入FAA固定液中。在室内, 将这一部分样品放入50%乙醇和甘油的混合液内, (两者比例为3:1), 在烘箱内恒温60℃下保持3~4d。然后将样品取出, 放入乳酸酚棉兰染液内染色。染色时间大约20min。用剃须刀片对染色后的样品进行手工切片。切片在木材横切面、弦切面和径切面上进行。样品切片置显微镜下观察、摄影、记录。

2 结果观察 2.1 蓝污真菌对韧皮组织细胞侵害的观察

观察结果显示, 蓝污真菌(L.yunnanense)菌丝可见于几乎所有韧皮组织细胞内。该菌菌丝在寄主细胞内主要沿细胞的走向生长、分布(图版Ⅰ-1、2)。例如, 它们在筛胞内呈轴向生长分布, 在韧皮射线薄壁细胞内呈径向生长分布, 而在蛋白质细胞和切向分布的韧皮射线薄壁细胞内则呈切向生长散布。根据切片观察, 该菌丝在径向、轴向和切向这3个方向上的转向主要是通过上述3类细胞的交汇点进行的。当菌丝沿着筛胞轴向生长遇到韧皮射线薄壁细胞后, 可以通过这两种细胞的交汇点进入到射线薄壁细胞, 然后沿着射线薄壁细胞走向, 向径向或切向方向生长分布。同样, 在韧皮射线薄壁细胞内径向生长的蓝污真菌的菌丝, 在遇到筛胞时也可改变方向, 进入到筛胞内呈轴向生长。筛胞、射线薄壁细胞以及蛋白质细胞在韧皮组织内纵横排列并又相互交错。蓝污真菌菌丝在这些细胞内生长、蔓延, 并利用这些细胞的分布规律, 形成了在韧皮细胞组织内的纵向、切向和径向的分布模式。

在韧皮组织中, 并行相邻的筛胞可由纹孔场形成的筛域连结。筛域内有一条原生质连索, 在筛胞间起着营养物质横向传输的作用。蓝污真菌(L.yunnanense)即通过这些筛域从一个筛胞进入到相邻的另一个筛胞。借助筛域在相邻细胞中生长是该菌在韧皮组织中径向发展的一种重要方式。菌丝体穿过相邻细胞时, 通常先形成一个钉状突起, 钉状的尖端先进入相邻细胞, 然后逐步长大呈一球状, 再由球状生长形成菌丝(图版Ⅰ-1、2)。

蓝污真菌(L.yunnanense)菌丝在其生长过程中, 亦形成分枝。这些分枝菌丝的出现有利于菌丝的生长发育。切片观察还发现, 蓝污真菌菌丝在韧皮组织中的粗径并不完全一致。有的菌丝较粗, 呈深棕色; 也有的菌丝较细, 略带浅棕色。它们都有营养菌丝。菌丝粗细差异可能与其养分获得状况有关。

2.2 蓝污真菌对木质部组织细胞侵害的观察

从木质部横截面被染蓝色的分布看, 蓝污真菌(L.yunnanense)多是以心材为圆心, 以树木周边为弧呈扇形散布的(图版Ⅰ-3)。该菌在木质部横截面的这一分布形式表明, 蓝污真菌进入到木质部后更快地沿径向方向扩展。

基于木质部细胞的排列结构观察, 蓝污真菌大体可以有两个途径从韧皮部进入到木质部内, 即:径向排列的木射线薄壁细胞或轴向排列的管胞的纹孔。组织切片显示, 蓝污真菌(L.yunnanense)菌丝通过管胞纹孔在细胞间进行径向生长的情形极少, 而在木射线薄壁细胞内呈径向分布的情况较多。由此推断, 该菌菌丝很可能是通过径向排列的木射线薄壁细胞进入到木质部的。

与在韧皮部内的生长分布相类似, 蓝污真菌(L.yunnanense)在木质部内的生长也主要是沿着木质部细胞的排列走向进行的。在径向上, 该菌丝沿着径向排列的木射线薄壁细胞生长蔓延。当菌丝抵达木射线薄壁细胞与轴向排列的管胞的交汇点—交叉场纹孔时, 可通过交叉场纹孔进入到轴向排列的管胞内, 继而沿管胞伸展方向呈轴向生长。蓝污真菌菌丝在管胞内轴向生长中, 若遇到径向排列的木射线管胞后, 可通过交叉场纹孔进入到木射线薄壁细胞内。轴向排列的管胞和径向排列的木射线薄壁细胞在木质部内呈纵横交错排列。这就为该蓝污真菌在木质部内的生长蔓延提供了一个纵横交错的“交通管道”。通过这些“管道”, 该菌菌丝得以在木质部内不断生长扩张。从木质部切片看, 木射线薄壁细胞和管胞内均含有大量蓝污真菌菌丝, 表明该菌菌丝在木质部内主要分布在这两种细胞中(图版Ⅰ-4)。

在蓝污真菌菌丝分布较多的地方, 蓝污真菌也出现在树脂管胞内。表明该蓝污真菌菌丝也可以在树脂管胞内生长(图版Ⅰ-5)。

与在韧皮组织细胞中的情形相似, 蓝污真菌(L.yunnanense)菌丝在木质部的细胞内也粗细不一。分析认为, 菌丝粗细的变化同样与该菌丝所获得的营养状况及生长程度有关。

3 讨论

上述对云南松受害组织解剖学观察, 揭示了纵坑切梢小蠹蓝污真菌(L.yunnanense)在云南松韧皮和木质部细胞内的生长与分布。蓝污真菌可以侵入到云南松树生活组织内, 汲取寄主植物营养物质, 并能在其组织细胞内生长繁衍。由此也近一步印证了纵坑切梢小蠹蓝污真菌(L.yunnanense)是云南松的一种寄生性病原真菌(周旭东等, 1998)。有关该菌的寄生性强弱和其危害作用的大小, 将在另外的文章中加以专门论述。

无论是在韧皮部或是在木质部, 蓝污真菌(L.yunnanense)菌丝均在组织细胞内生长, 并主要沿着细胞排列走向蔓延。蓝污真菌菌丝在组织细胞内沿着细胞走向生长可以更加充分地利用细胞营养物质。由此, 蓝污真菌菌丝在植物组织内生长蔓延方向的转变, 多发生在3种排列细胞的交汇部位。例如, 在韧皮组织内, 蓝污真菌菌丝主要通过韧皮射线薄壁细胞和韧皮筛胞的交汇处, 从一种细胞进入到另一种细胞, 并由此从一个扩张方向转为到另一个方向。此外, 该蓝污真菌菌丝也可以借助韧皮细胞的筛域在相邻细胞间进行横向扩张。该菌菌丝借助筛域在相邻细胞间的横向扩张明显小于在寄主组织细胞内的纵向扩展。所以, 云南松韧皮组织受害后所形成的反应区斑块呈纵椭圆形(图版Ⅰ-6)。而在木质部中, 蓝污真菌菌丝主要沿着径向排列的木射线薄壁细胞生长和散布。木射线薄壁细胞被认为是营养物质和水份的主要场所, 进行营养物质和水份的横向传输(Zimmerman et al., 1977)。该细胞也由此为蓝污真菌提供了理想的养料和生长、散布的场所(Zimmerman et al., 1977; Ballard et al., 1984), 也因此木质部受害后形成的蓝色斑块系以心材为圆心呈扇形散布(图版Ⅰ-3)。

蓝污真菌对寄主木质部的危害表现为, 大量菌丝充塞木质部管胞内, 使管胞丧失正常的水份输送功能(Ballard et al., 1984; Nelson, 1934)。也有研究表明, 除了蓝污真菌的这种直接的作用外, 该菌还可以诱导木质部组织发生另一些适应性反应。例如, 受到蓝污真菌危害后, 木质部组织还会形成松脂斑和失水斑(叶辉, 1997a; 1997b;Solheim et al., 1993)。这两种斑块都将阻挡木质部水份的正常输送。还有研究发现, 在蓝色斑块附近的细胞内, 其水份输送能力也将受到影响(Solheim et al., 1993; Nelson, 1934)。

研究发现该菌菌丝粗细变化的现象在国外其它蓝污真菌研究中也有类似报导(Ballard et al., 1984)。