林业科学  2001, Vol. 37 Issue (6): 52-58   PDF    
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田呈明, 梁英梅, 康振生, 李振岐, 赵彦修.
Tian Chengming, Liang yingmei, Kang Zhensheng, Li Zhenqi, Zhao Yanxiu.
杨树与栅锈菌互作的组织病理学研究
HISTOPATHOLOGY STUDIES ON INTERACTION OF POPLARS AND LEAF RUST WITH DIFFERENT COMPATIBILITIES
林业科学, 2001, 37(6): 52-58.
Scientia Silvae Sinicae, 2001, 37(6): 52-58.

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收稿日期:2000-09-11

作者相关文章

田呈明
梁英梅
康振生
李振岐
赵彦修

杨树与栅锈菌互作的组织病理学研究
田呈明1 , 梁英梅1 , 康振生2 , 李振岐2 , 赵彦修3     
1. 西北农林科技大学林学院 杨凌 712100;
2. 西北农林科技大学植物保护学院 杨凌 712100;
3. 山东师范大学生物系 济南 250014
摘要: 用整叶组织透明染色法对亲和性、非亲和性杨树品种与落叶松 杨栅锈菌(Melampsora larici-populina Kleb.)相互作用的组织病理学进行了系统的观察。夏孢子接种6h后开始萌发, 12h后芽管侵入气孔, 此后在寄主细胞内形成吸器。芽管常形成树杈状或根状分枝, 一个芽管分别侵入两个气孔或几个芽管同时侵入一个气孔。杨树与栅锈菌相互识别中的抗锈性的表达主要发生在接种24h后, 即气孔下囊形成阶段。表现为夏孢子萌发初期受抑, 气孔下囊形成较迟、数量较少, 初生侵染菌丝的长度受抑, 吸器出现迟、数量少以及寄主叶肉细胞坏死等, 但不同组合间在发生时间和程度上有较大差异。接种12h后, 感病品种的叶肉细胞中出现吸器, 36h后抗病性组合中出现吸器。随着菌丝的增多, 抗病品种中的吸器数量、菌落面积小于感病品种, 多于近免疫品种。低反应型品种中菌落线性生长受抑和吸器形成的减少均发生在叶肉细胞坏死之后, 、尚未发现高感品种出现叶肉细胞坏死现象。
关键词: 杨树    落叶松—杨栅锈菌    组织病理学    
HISTOPATHOLOGY STUDIES ON INTERACTION OF POPLARS AND LEAF RUST WITH DIFFERENT COMPATIBILITIES
Tian Chengming1, Liang yingmei1, Kang Zhensheng2, Li Zhenqi2, Zhao Yanxiu3     
1. Faculty of Forestry, Northwest Sci-Tech University of Agriculture & Forestry Yangling 712100;
2. Faculty of Plant Protection, Northwest Sci-Tech University of Agriculture & Forestry Yangling 712100;
3. Dept.of Biology Shandong Normal University Ji' nan 250014
Abstract: The histopathological manifestation of interactions of poplars cultivars and leaf rust(Melampsora larici-populina Kleb.)with different compatibilities was investigated by using whole-leaf cleaning and staining technique at various times after inoculation. The results showed that the urediospore germinated 6 h after inoculation on poplar leaf, and then germ tube grew into stoma and haustorium was formed in the host cell 24 h after inoculation. Germ-tube always branched into several tubes and infected two stomas, or several tubes infected one stoma at the same time. Resistance expression occurs 24 h after inoculation, but there were differences among different compatible combinations. As to resistant host combination, urediospore germinating process and growth rate of germ tube were restrained, and haustorium formed later (36 h after inoculation) and small in number; the number of substomatal vesicle on leaf was small and cell death frequently occured. As to compatible combination, haustorium formed 24 h after inoculation. The number of haustorium and the size of colony in resistant species were smaller than those of the susceptible ones, but larger than the near-immune ones.
Key words: Poplar    Melampsora larici-populina    Histology    

青杨叶锈病(Melampsora larici-populina Kleb.)广泛分布于世界各杨树栽培区, 危害杨树幼苗、幼树生长, 并造成材积损失, 严重影响杨树用材林及防护林的发展(田呈明等, 1999)。实践证明培育抗病品种是防治该病的最理想的措施, 而栅锈菌为高度专化寄生菌, 变异快、易产生新的生理小种, 从而导致杨树品种丧失抗病性, 严重制约杨树人工林的发展。

有关杨树与栅锈菌互作的组织病理学研究报道甚少, Spiers和Hopcroft(1985)简单描述了自然感病杨树上M.larici-populinaM. medusae的夏孢子发育情况。Werner (1981)介绍了栅锈菌侵染杨树过程的组织变化, Laurans和Pilate(1999)首次描述了落叶松—杨栅锈菌(M. larici-populina)的E1、E2小种接种一个简单杨树无性系后的组织病理学变化。本文应用整叶组织透明染色技术, 系统研究不同抗性杨树品种与栅锈菌不同菌系互作时的组织病理学特征, 为认识和合理利用寄主抗病性, 控制病害的发生流行奠定基础。

1 材料和方法 1.1 供试菌株与品种

供试菌株为落叶松—杨栅锈菌(M.larici-populina)夏孢子的4个单孢子菌系: BT(陕西太白、小叶杨)、XN(青海西宁、青杨)、TS(陕西眉县、太白杨)和SB(陕西宝鸡、太白杨)。菌株分离及繁殖均按李振岐等(1989)的单孢分离及涂抹法进行。

研究用杨树无性系为青杨(Populus cathayana)、44-117杨(P.deltoides × P.trichocarpa)、欧美杨(Populus × euramericana)和太白杨(P. purdomi)、美洲黑杨(P. deltoides)等。杨树抗锈病的反应型的分级标准依据田呈明等(2000a; 2000b)的标准; 不同杨树品种对各菌株的反应型见表 1

表 1 不同杨树品种对栅锈菌菌株的反应型 Tab.1 Reaction type of the isolate on different poplar varieties
1.2 接种方法及取样

取新鲜夏孢子悬浮液(5×106个夏孢子·mL-1), 均匀涂抹于叶背, 喷雾并保湿24 h后, 将接种苗放回生长箱中, 在18~23 ℃下继续培养。自接种后6, 12, 24, 36, 48, 72, 96和120 h, 随机在每个处理取样一次, 每次每个处理取5片叶, 剪成约30~50个小块。

1.3 染色处理及观察

将叶片的叶缘剪去后, 剩余部分切成1 cm2的小片, 按改进的Bruzzese(1983)整叶透明染色法进行处理并改进, 染色48~60 h后, 在饱和水合氯醛中(2.5 g·mL-1)中脱色48~72 h, 经蒸馏水冲洗后在光镜下观察。

1.4 观察指标

(1) 夏孢子萌发率及气孔下泡囊数量:将50~100个不同视野的夏孢子萌发数和气孔下泡囊的形成数进行统计, 并计算夏孢子萌发率。

(2) 初生侵染菌丝长度:气孔下囊至最长伸展菌丝顶端或菌丝水平伸展的最大直线距离。

(3) 吸器数量:每个侵染点菌落中形成的吸器平均数。

(4) 菌丝扩展面积: S=π/4×菌落长度×菌落宽度。

(5) 叶肉细胞坏死面积:单个侵染点细胞坏死面积。

2 结果与分析 2.1 杨树与栅锈菌互作的宏观表现

在亲和性组合中, 感病品种44-117杨、太白杨等接种不同菌株均表现为典型的“3”型或“4”型反应。叶组织中, 菌丝分枝多, 菌落在表皮下发展聚集形成孢子床, 接种4 d后叶面出现褪绿斑, 第5 d夏孢子堆突破表皮外露, 出现橙黄色小疱, 成熟时大小为1~2 mm。周围组织无枯死反应, 早期无失绿现象, 属高度感病和中度感病型。

在非亲和性组合中, 青杨接种TS、BT、XN等菌株时表现为“1”型反应, 接种SB菌种时为“2”型反应; 欧美杨接种SB、BT等菌株表现为“2”型反应。叶内胞间菌丝在形成吸器后常引起寄主细胞的坏死, 多数在泡囊分化出菌丝后即有寄主细胞死亡, 在接种后第7 d出现微小到中等的夏孢子堆, “2”型反应的夏孢子堆周围有褪绿或枯死反应。美洲黑杨对所有菌种均表现为“0; ”型反应, 即近免疫反应。其叶内胞间菌丝分枝较少, 接种后24~36 h出现细胞坏死, 在第13 d后叶面仅出现轻微失绿, 但无枯斑和夏孢子堆出现。

2.2 栅锈菌在不同杨树品种上的萌发特点

夏孢子接种感病杨树品种叶片6h后开始萌发, 每个夏孢子萌发时产生1~3个芽管, 与一般锈菌不同的是杨树锈病菌的夏孢子芽管在伸长时常形成丰富而粗壮的树杈状分枝或根状侧枝, 分枝角度接近90度。有时还形成菌丝环、菌丝结节等。24 h后, 附着胞上产生的芽管成功侵入气孔, 并形成圆形或椭圆形的气孔下泡囊, 大小5~7 μm。

接种24 h后不同抗病性的品种上的夏孢子均开始萌发(表 2)。在近免疫或高抗品种上萌发较慢, 萌发率较低, 平均为3.02 %; 在中感品种上的萌发率为4.47 %; 在高感无性系上萌发快, 萌发率较高, 平均为14.63 %。在接种36 h后, 亲和与非亲和无性系之间的夏孢子的萌发率均70 %以上, 48 h后的萌发率均在92.11 %以上。非亲和性反应对孢子萌发初期的影响, 可能与寄主表面特征及其分泌物有关。

表 2 接种24 h后不同品种上的夏孢子萌发率 Tab.2 Germinating rate of urediospore 24 h after inoculation
2.3 组织病理学观察 2.3.1 感病品种组织病理学观察

在适宜培养条件(温度20 ℃, 饱和湿度状态)下, 接种后6 h, 夏孢子开始萌发, 24 h后, 在不同种类杨树的气孔下均形成圆形或椭圆形的气孔下囊(表 3)。接种24h后至72 h, 不同品种与菌种组合的气孔下囊产生率逐渐增加, 但“4”型与“3”型反应的差异不显著。

表 3 不同品种气孔下囊产生率 Tab.3 Engender rate of substomatal vesicle on different varieties(%)

在接种24 h后不同感病品种都从泡囊上长出1~3枝初生菌丝, 然后分别向气孔腔周围扩展。36 h后侵染菌丝扩展速度的差异逐渐扩大, 高感品种的初生侵染菌丝长度在85 μm以上, 而中感品种为68.47 μm(表 4)。随着菌丝的增多, 菌落大小也出现差别。

表 4 接种不同品种后初生侵染菌丝长度比较 Tab.4 Length of infection hyphae on different varieties

吸器是锈菌侵入寄主组织并扩展后, 在吸器母细胞基础上形成的侵染结构。吸器出现的早晚及其数量的多少, 反映出不同寄主—锈菌组合中的抗病性差异。接种后12 h, 感病品种44-117杨的叶肉细胞中便出现了吸器, 且吸器数量高于中感品种欧美杨和太白杨(接种SB、TS)。在接种后36 h后吸器数量急剧增加, 到72 h时不同感病杨树无性系之间的吸器数量相差不大(表 5)。

表 5 不同品种与菌种组合的吸器数量比较 Tab.5 Number of haustorial on combination of different host and isolates

初侵染菌丝侵入叶肉细胞后, 形成初生吸器母细胞, 其后发生分枝, 形成次生菌丝, 在叶肉细胞间蔓延, 并不断分枝形成菌落。接种后72 h内, 菌落扩展面积较小, 中感品种的菌落扩展面积低于高感品种。96 h后菌落面积显著增加, 但此时“3”型反应与“4”型的差别不大(表 6)。随着菌落的进一步扩展, 在接种后第4~5 d叶面出现褪绿斑, 第6 d叶面出现夏孢子堆。

表 6 菌落扩展面积 Tab.6 Expansion area of colony
2.3.2 抗病品种的组织病理学观察

欧美杨接种BT菌株后, 反应型为“2”, 属中度抗病反应。不同杨树种或品种之间在抗侵入能力上有一定差异, 抗病品种的侵入率低于感病品种; 而在同一品种组合中的不同反应型, 在侵染初期的差异较大, 但在接种36 h后逐渐缩小。接种24 h后气孔下囊产生率为2.07 %, 初生侵染菌丝长度为24.14 μm, 明显低于感病对照, 表明芽管侵入受到抑制。

青杨接种BT菌株后的反应型为“1”, 属高度抗病反应。在24 h后的气孔下囊产生率、初生侵染菌丝长度、吸器数量、菌丝扩展面积等与欧美杨相似。

与感病品种相比, 不同抗病品种在接种后24h均未产生吸器, 中抗或高抗品种在36h后出现吸器; 中抗或高抗品种在36h时的吸器数量平均为3.46, 远低于感病品种的14.07(表 7)。

表 7 抗病品种的组织病理学特征比较 Tab.7 Character of histopathological on resistance variety

120 h后感病品种的菌落仍在扩展, 而抗病反应的寄主细胞已坏死, 菌落难以看清。48 h后, 高抗品种(青杨)上, 菌落的扩展速度十分缓慢, 初生菌丝侵染长度为27.36 μm, 远远低于感病品种。不同抗性的抗病品种中也有一定差异, 如青杨(高抗)的气孔下囊产生率在侵染初期低于美洲黑杨(近免疫), 但在36 h后的侵入率高于近免疫品种。

2.3.3 近免疫品种的组织病理学观察

与抗病品种相比较, 美洲黑杨接种24 h后(BT菌株)的气孔下囊产生率远远低于感病对照, 且增加幅度较小, 72 h后气孔下囊产生率为3.29 %, 而此时感病对照已超过56 %。接种后同一时间的初生侵染菌丝长度比对照少4倍多, 48 h后, 随着坏死寄主细胞的出现, 侵染菌丝生长严重受阻(近免疫品种); 吸器产生于24 h以后, 其数量比同时间感病品种的吸器数量少近10倍(表 8)。

表 8 近免疫品种的组织病理学特征比较 Tab.8 Character of histopathological on near-immune variety

不亲和组合中因寄主细胞的坏死, 菌丝扩展很慢或不能扩展, 美洲黑杨在接种后48~72 h的菌落扩展面积略高于高抗品种青杨, 96 h后青杨以及感病品种的菌落面积随侵染时间的不断增加随之增加, 但美洲黑杨已观察不到菌落扩展现象。接种后72 h内菌落扩展面积较小, 96 h后菌落面积显著增加, 但此时“3”型反应与“4”型的差别不大。随着菌落的进一步扩展, 在接种后第4~5 d叶面出现褪绿斑, 第6 d叶面出现夏孢子堆。

3 结论与讨论 3.1 孢子萌发

夏孢子接种感病杨树品种叶片6 h后开始萌发, 每个夏孢子萌发时产生1~3个芽管, 芽管在伸长时常形成丰富而粗壮的树杈状分枝或根状侧枝, 有时还形成菌丝环、菌丝结节等。12 h后附着胞上产生的芽管成功侵入气孔, 并形成圆形或椭圆形的气孔下泡囊。

接种后24 h之内, 不同抗性的品种上的夏孢子萌发率差异显著, 近免疫或高抗品种上萌发较慢, 萌发率较低; 高感无性系上萌发快, 萌发率较高。但在48 h后, 不同品种上的夏孢子萌发率均在92.11 %以上。Mlodziawski(1978)通过扫描电镜也发现, 夏孢子在感病无性系上萌发较快, 24 h后菌丝大量分枝; 感病杨树的叶下表面皱褶多, 气孔数量及长、宽都大。而抗病无性系上萌发较慢, 24 h后只形成少量分枝菌丝。侵染初期不同品种间的萌发率的差异, 可能与寄主表面特征、病菌对寄主的识别等有关。

3.2 锈菌的侵入行为

接种后12 h, 感病品种的叶肉细胞中便出现了吸器, 36 h后抗病性组合中出现吸器, 但少而小; 中抗品种的吸器形状变化较大, 圆形、椭圆形或桶状, 一个细胞内有2~3个吸器; 近免疫品种中的吸器, 在形成之后便迅速坏死。

在不同锈菌菌系与杨树品种(或种)的组合中, 栅锈菌侵入之前的行为并无明显区别, 类似于小麦条锈病菌、亚麻锈病菌(刘松洁等, 1991)。而锈菌中的大多数种类在侵入植物叶片时, 常产生附着胞等侵入结构, 如大麦叶锈菌不能侵入莴苣上的原因就是由于夏孢子不形成附着胞的缘故。本研究发现M. larici-populina的夏孢子芽管萌发侵入叶片时, 不产生典型的附着胞, 芽管直接由气孔侵入。有时在芽管顶端形成分枝, 分别向两个气孔侵入, 或几个芽管侵入同一个气孔。有时虽在远离气孔的区域经常形成附着胞, 但未发现芽管直接入侵寄主表皮细胞的现象, 与Shain and Jarlfors(1987)M. madusaeP.deltoides上的观察结果一致。而Omar(1979)曾认为M. larici-populina的夏孢子芽管可直接穿透寄主表皮入侵, 但Shain等(1987)人的研究发现, 芽管形成附着胞并产生入侵栓侵入寄主表皮以后, 受到寄主强烈的抑制反应, 在侵入钉周围分泌大量的胼胝质物质形成乳突状结构, 限制病原菌的扩展, 使其不能产生初生侵染菌丝或吸器等结构, 从而导致侵入失败。

3.3 杨树品种与栅锈菌的相互识别与抗性表达

不同亲和性组合之间, 在侵入率以及胞间初生菌丝的扩展等方面表现出差异, 与M. medusaeP. deltoides以及M. liniLinum usitatissinum互作中的组织病理学表现极为相似。接种24 h后不同杨树品种的气孔下均形成泡囊, 但不同品种之间的抗侵入能力有差异, 抗病品种的侵入率低于感病品种; 而在不同抗性的抗病品种中也有一定差异, 高抗品种的气孔下囊产生率在侵染初期低于近免疫。非亲和反应的初生侵染菌丝长度远远低于亲和性组合中的高感品种, 且菌落扩展慢, 线性长度较小。上述侵染早期(第一个吸器出现之前)的许多防卫反应显示与非寄主抗病性有关, 这与Heath(1977)提出的“吸器前抗性”相似, 包括萌发率的降低、芽管对气孔的识别、阻止气孔下囊、初生菌丝及吸器等侵染结构的形成等。Siweeki(1980)认为菌丝侵入抗病杨树(Populus deltoides)后, 受阻于叶肉细胞, 处于产生吸器母细胞阶段, 此时病菌及邻近寄主细胞死亡, 导致枯斑产生。但杨树对落叶松—杨栅锈菌的抗性表达可能发生于气孔下囊形成阶段, 即接种后24~36h。与以往对燕麦冠锈菌、小麦锈病菌的研究结果相一致。

寄主的专化性抗病性的表达是在第一个吸器出现之后。“0; ”型反应在接种后24~36 h出现细胞坏死, 菌丝扩展很慢或不能扩展, 病菌在细胞内的扩展被快速局限化, 但外观无任何症状表现, 接种后第13 d仅在叶面出现轻微失绿, 无枯斑和夏孢子堆出现。

亲和性互作中, 受侵寄主细胞与其它细胞相类似, 病菌侵入后并未损伤寄主细胞; 而且在夏孢子产生时, 寄主细胞中仍有吸器存在, 仍未发现寄主细胞坏死现象。

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