锥栗(Castanea henryi)是一种原产于我国的著名干果, 具有较高的经济价值, 对我国山区的经济发展起着十分重要的作用。其种子属于亚热带典型的顽拗性种子(傅家瑞, 1991), 目前尚无进行锥栗种子种质长期贮存的成功报道。LN₂保存是近年来飞速发展起来的一种种质保存新技术, 目前研究对象多数以蔬菜、粮食种子, 而以林木种子为对象的研究极少。在LN₂(-196 ℃)状态下, 一切的生理代谢和分裂活动基本上都处于静止状态(殷晓辉等, 1996; Mantell et al., 1983), 有研究表明, 在LN₂中保存植物材料不受保存时间的限制, 长期保存不会降低保存材料的活力(简令成, 1990)。通过适度脱水, 来保证LN₂冷冻或解冻过程中避免或减轻低温伤害是LN₂保存的成功关键(傅家瑞等, 1993; Ruhl et al., 1988); 和种子相比, 种胚具有较高的脱水耐性和较弱的低温敏感性, 而且蕴含了种子绝大部分的遗传信息, 体积小, 是LN₂保存的理想材料(Chandel et al., 1995; Pence et al., 1992; Grout et al.1983)。LN₂保存已在医学、微生物和畜牧业上被广泛应用, 由于LN₂保存为“无限期”保存提供了可能(王君辉等, 1998), 因此, 对顽拗性种子种质长期保存开辟了一个引人入胜的应用前景。但是用于种子保存的试验为时尚短, 尤其在林木种子保存方面研究极少, 这给成功地实现林木种子的LN₂中长期种质保存造成很大的困难。利用锥栗种子为实验材料, 通过对锥栗离体胚进行LN₂保存试验, 采用不同的含水量水平, 运用不同的防冻剂预处理、冷冻方式和解冻方式, 探讨在LN₂保存过程中脱氢酶活性和淀粉酶活性随各因素和水平变化的内在规律, 为锥栗种子的长期种质保存提供理论依据和参考。

1 研究材料和方法 1.1 研究材料

研究材料主要是壳斗科常见种锥栗种子及其离体胚, 统称为保存材料。

1.2 研究方法 1.2.1 含水量(MC)

将锥栗种子, 在其种胚部不伤及胚的前提下, 切取约5 mm×3 mm×3 mm大小的胚方, 用30 ℃、硅胶条件下使其失水至相对含水量为25 %、20 %、15 %、10 %、5 %等各含水量梯度, 不失水的为自然含水量(NMC), 以不经液态氮处理的为对照(CK)。种子的各含水梯度处理与离体胚的类似。

1.2.2 冷解冻程序

按正交试验设计L₁₈(6¹×3⁶) (洪伟, 1991), 进行因子水平安排(表 1), 采用有、无防冻剂预处理方法对材料进行各种冷冻处理, 然后进行液态氮保存, 各种解冻处理后(图 1), 进行脱氢酶活性和α-淀粉酶活性测定。

1.2.3 种子发芽

参照1996年国际种子检验规程的规定(ISTA编, 1999)。并计算种子的发芽指数和活力指数。发芽指数: GI=∑G_t/D_t。G_t :在时间t日的发芽数, D_t :相应的发芽日数

活力指数:VI=GI×L。L :幼根平均长度

1.2.4 脱氢酶活性测定

TTC染色法(黄学林等, 1990)。取待测离体胚4个重复, 每重复25粒种子, 在45 ℃温水浸种24 h(以增强离体胚的呼吸强度, 使显色迅速), 取胚, 然后按“TTC定位图形法”作种子生活力鉴定和分光光度计法定量测定TTCH含量。

1.2.5 α-淀粉酶活性测定

I₂-KI显色法(黄学林等, 1990)。反应体系包括1 mL 1 mg·mL^-1淀粉溶液和1 mL 0.01 mol·mL^-1 pH=4.8醋酸反应缓冲液。剥取种胚, 用5 mL的醋酸研磨缓冲液匀浆, 然后将提取液放在70 ℃恒温水浴20 min, 在4000×g下离心5 min, 研磨缓冲液定容至10 mL, 作为酶制剂。然后吸取酶制剂1 mL加入到反应体系中, 在37 ℃恒温水浴0, 5和10 min后, 再分别吸取反应混合液0.3 mL迅速加入1 mL显色剂和3mL蒸馏水, 摇匀, 测OD₆₂₀(0), OD₆₂₀(5)和OD₆₂₀(10)值。淀粉酶活性用mg·min^-1表示。

2 结果与分析 2.1 自然质量特性

对锥栗的种子, 进行发芽试验。各试验4个重复, 每重复50粒。计算出各树种的发芽率、发芽指数和活力指数(表 2)。新采收的锥栗种子的原始发芽率较高, 达84 %, NMC较高, 为48.9 %。实验过程中发现, 将锥栗种子于5 ℃的贮藏温度条件下保湿贮藏, 在福建较高的温度和湿度的环境条件下, 锥栗种子从采摘时间(10月中旬)开始, 经5~6个月(翌年3月~4月)大部分开始发芽, 贮藏时间很短。

2.2 LN₂保存对锥栗种子发芽率的影响

将不同含水量的种子按照L₁₈(6¹×3²)正交试验设计经过不同的冷冻方式和解冻方式处理后进行发芽率测定。将锥栗种子发芽试验统计结果列入表 3。分析结果表明, 对锥栗发芽率造成显著差异的是种子含水量, 其极差R值为47.33;冷冻方式和解冻方式处理间差异较小。因此, 种子含水量和锥栗种子LN₂保存成功的关键因素。15 %~25 %MC之间锥栗种子发芽率较高。锥栗为20 %MC, 发芽率达到53.67 %; 缓冻慢解方式的平均发芽率比较高。

2.3 锥栗种子胚脱氢酶活性分析 2.3.1 不同处理锥栗离体胚脱氢酶活性对比

锥栗离体胚在30 ℃, 硅胶条件下失水至各种含水量过程中, 其TTCH含量变化规律随着失水程度增加, 其TTCH含量不断降低, 降低幅度不断增大(表 4)。

新鲜的锥栗种子TTCH含量极高, 达104.29 μg·mL^-1·10个胚^-1, 脱氢酶活性强, 种子呼吸旺盛, 代谢能力强, 这归因于新鲜的锥栗种子的高含水量使种子保持旺盛的代谢能力; 自然状态下放置15 d后, 种子的TTCH含量与含水量呈线性负相关。在不同处理的种子中, 密封、常温条件下贮藏一段时间后, 含水量越高的种子劣变越快, 表现为TTCH含量降幅越大, 降低越迅速。当种子的含水量降低至10~15 %这个范围时, TTCH含量降幅最小, 而且能够维持在较高水平(表 4)。LN₂保存处理, 锥栗种子在15 %~20 %MC范围内TTCH含量最高, 降幅最小, 能够较好地维持活力, 采用这个含水量范围较为合适。防冻剂能够较大地消除由于含水量的影响而造成的差异, 使20 %~25 % MC经LN₂保存后仍能保持较高的TTCH含量, 即较好地维持种子活力。

2.3.2 无防冻剂预处理LN₂保存胚脱氢酶活性变化

LN₂保存后离体胚脱氢酶活性随含水量的变化而改变, 呈倒抛物线形趋势(图 2)。NMC处理TTCH含量有明显地降低, 20 % MC的离体胚TTCH含量最高, 但与LN₂保存前的相比, TTCH含量稍微有些下降, 而15 %MC水平的离体胚TTCH含量则较接近于保存前的水平, 而且, 15 %和20 %MC的TTCH含量高, 能够较好地保存与维持离体胚活力。LN₂保存中冷冻速度对锥栗离体胚脱氢酶含量影响甚微。而解冻过程对锥栗离体胚脱氢酶含量有显著影响, 适当控制解冻时温度上升速度, 则能提高脱氢酶活性, 离体胚受到的伤害较小, 如QF。从3因素极差趋势对比来看, 含水量造成的TTCH含量差异最大, 为12.54 μg·mL^-1 10胚^-1, 其次是解冻方式, 冷冻方式最小。因此, 含水量与解冻方式是应考虑的2个要素(图 2)。

方差分析进一步表明(表 5), 含水量因素的统计量F(5, 8)=3.958大于临界统计量F_0.05(5, 8)=3.688, 达到显著水平; 解冻方式的统计量F(2, 8)=7.469大于临界统计量F_0.05(2, 8)=4.459, 也达到显著水平; 而冷冻方式之间差异并不显著。

采用Q检验法多重比较分析表明, 在10 %以上含水量各水平之间不存在显著差异, 20 %MC TTCH含量最高, 且与5 %MC水平之间差异性显著, 宜采用20 %MC水平。解冻方式多重比较分析表明, 缓解和慢解之间差异不显著, 而缓解和快解二者之间存在有显著差异, 测定结果表明缓解明显优于其他两种解冻方式。因此, 采用缓解比较适宜(表 5)。

2.3.3 防冻剂预处理后LN₂保存TTCH分析

将不同含水量的锥栗种子离体胚, 采用L₁₈(6¹×3⁴)正交试验设计, 对含水量水平、冷冻方式、解冻方式、甘油和二甲亚砜(DMSO)等5因素, 进行LN₂保存试验安排, 用TTC染色后, 进行TTCH含量测定。

当含水量在15 %水平以上时, TTCH含量变化极其平缓, 含量高且变幅很小, 都处于28~30 μg·mL^-1 (10胚)^-1之间范围内, 当含水量小于15 %时, TTCH含量急剧下降, 这说明, 防冻剂预处理对脱水伤害的修复影响较小, 但能使离体胚在冷冻过程和解冻过程中所造成的低温伤害降低到最小限度。防冻剂预处理后最佳的保存含水量为25 %, TTCH含量最高。此外, 直接用NMC进行添加防冻剂LN₂保存锥栗离体胚, 其保存效果并非最佳; 缓冻和慢解方式TTCH含量平均值均为最大, 但冷冻方式和解冻方式的极差要比含水量因素极差小得多, 故含水量是影响LN₂保存的重要因素(图 3(a))。锥栗离体胚添加防冻剂处理LN₂保存中, ≥15 %含水量的各水平之间和≤10 % DMSO的各水平之间差异性均不显著, 宜采用处理组合为≥15 %MC-MF-ST处理方式(图 3(b))。因此, 防冻剂组合应采用≥15 % MC、≤10 % DMSO, 而较佳的组合为25 %MC-5 %DMSO-10 %甘油。

2.4 离体胚LN₂保存α-淀粉酶活性变化

α-淀粉酶是种子转向萌发生长过程中, 将种子内贮藏大分子物质淀粉分解为可吸收利用的小分子物质过程的一种重要的酶。其活性高低直接影响到种子萌发生长过程的能量和各种中间产物的供应。

2.4.1 无防冻剂预处理

采用L₁₈(6¹×3⁴)正交试验设计进行锥栗离体胚LN₂保存, 然后进行α-淀粉酶活性测定, 结果见表 6。

LN₂保存后锥栗种子离体胚, 影响α-淀粉酶活性的主导因素还是含水量, 其极差R值最大达到0.405 mg·min^-1; 其次为解冻方式, 其R值为0.109 mg·min^-1; 影响力最小的因素为冷冻方式, 其R值仅为0.052 mg·min^-1。从各含水量水平处理的α-淀粉酶分解淀粉能力来看, 不同的含水量水平的α-淀粉酶活性存在较大差异, α-淀粉酶活性最大的15 %MC, 其分解淀粉能力最强, 达0.675 mg·min^-1。最佳组合为: 15 %MC, MF-QT(表 6)。

2.4.2 防冻剂预处理后

锥栗离体胚经防冻剂预处理后进行LN₂保存时, α-淀粉酶的活性随含水量的下降成先升高后下降, 含水量为20~25 %时, 其α-淀粉酶的活性维持在较高水平。说明为保持较高的α-淀粉酶的活性, 经防冻剂处理后, 可提高其LN₂保存时的最佳含水量, 这可极大地减轻离体胚失水过程中造成的脱水伤害, 从而也有利于α-淀粉酶的活性的保持。其次, 甘油和聚乙二醇对锥栗α-淀粉酶的活性有较大影响, 冷冻和解冻方式对α-淀粉酶的活性影响较小, 较佳组合为20 %MC, SF-ST, 10 %甘油-5 %二甲亚砜-5 %蔗糖(表 7)。

3 讨论

锥栗属于我国亚热带地带常见的顽拗性林木种子之一, 其种子种质长期保存难的问题困扰着林业生产对种子随取随用的需求。锥栗种子从母树上脱落时, 自然含水量极高, 种子可能已开始转向萌发方向发展, 种子休眠期极短, 种子成熟过程中各种抗脱水的防御机制极不完善, 因而对脱水十分敏感(姜孝成等, 1995; 宋松泉等, 1999)。脱氢酶活性是迅速可靠检验种子活力的方法之一, 脱氢酶活性的下降, 常伴随着种子发芽力的迅速丧失。对锥栗种子LN₂保存前后的各含水量处理的胚脱氢酶活性分析可知, 含水量是影响锥栗种子活力保存的一个极其重要的因素。锥栗种子胚脱氢酶活性变化与含水量密度相关, 过度脱水会造成脱氢酶活性剧烈下降甚至直接导致活性丧失。

通过对锥栗种子离体胚LN₂保存后的脱氢酶活性测定, 经方差分析, 结果表明其差异达到显著水平; Q检验法多重比较分析表明, 20 % MC TTCH含量最高且与5 %MC水平之间差异性显著, 缓冻明显优于其他两种解冻方式; 直接用NMC的锥栗离体胚进行LN₂保存, 其保存效果并不好, 而应当要适度脱水。当含水量下降到20 %时, 离体胚生活力保存率最高, 反映在其脱氢酶活性(TTCH含量)最高, 可能此时脱水尚未对锥栗离体胚造成严重地脱水伤害。LN₂保存过程中, 解冻方式对锥栗种子离体胚LN₂保存的影响达到显著水平, 其中以MF-MT方式保存最好。α-淀粉酶活性分析也表明, 影响LN₂保存的主导因素是含水量, 最佳的冷冻方式是缓冻, 最佳的解冻方式是快解, 其次是缓解。故LN₂保存宜采用15 %~20 %含水量区间, 冷解冻方式采用MF-MT。

防冻剂的作用是通过降低保存材料的冰晶形成的临界点, 使保存材料顺利和通过低温危险区(-2 ℃~-140 ℃), 减少低温伤害(舒理慧等, 1993)。防冻剂预处理后, 锥栗种子的离体胚酶活性分析表明, 能够保存最高脱氢酶活性的含水量从20 %提高到25 %, 而α-淀粉酶活性则从15 %提高到20 %。故防冻剂能够较大消除由较高的含水量造成的低温伤害和酶活性差异。同时也减少保存材料的失水至最佳保存含水量的时间, 减少因脱水而造成的伤害。当添加防冻剂后, 冷冻方式对各种酶活性影响较小, 而解冻速度宜变慢, 这更有利于酶活性的保持。如采用慢解方式, 脱氢酶活性与α-淀粉酶活性均较高。