种质资源的收集和管理是一项复杂而艰巨的工作(Virk et al., 1995), 其遗传变异研究对林木遗传改良具有重要意义(Liu et al., 1993)。遗传变异研究既可以用谱系或杂种的表型资料, 也可以用同工酶数据, 还可用DNA水平的分子标记数据(Smith et al., 1992)。近年来, 分子标记已广泛而有效地用于估测育种材料的遗传变异(Lee, 1995), 其中RAPD (Random amplified polymorphic DNA, 随机扩增多态性DNA)是较好的一种分子标记技术(Welsh et al., 1990; Tinker et al., 1993)。

杉木(Cunninghamia lanceloata (Lamb.) Hook)是我国重要的商品用材树种, 杉木良种选育已经取得了显著成效并在林业生产中发挥了巨大作用¹⁾。虽然, 杉木种质资源的遗传变异水平对其丰度评价、保护策略制定和长期遗传增益的保障有重要价值(施季森等, 1993), 但目前却较少研究。本研究利用RAPD分子标记技术对收集自8个省份的30株杉木优树进行了遗传变异分析, 这可为标记辅助的优树鉴定、杂交亲本选配和育种群体多样性评价等研究奠定良好的基础。

¹⁾施季森.大陆林木遗传改良及分子遗传研究发展。海峡两岸林业科技交流学术讨论会论文集, 台北, 1997.

1 材料和方法 1.1 植物材料

30株杉木优树收集自8个省区的家系实验林(表 1), 选优标准为树高和胸径, 采用5株优势木法, 于1972年嫁接保存于福建省国营洋口林场杉木基因库中。

1.2 随机引物

用于RAPD扩增的10 bp随机引物购自Operon公司, 初筛OPA、OPB、OPC、OPD、OPE和OPF字头共120个引物, 筛出正式扩增引物26个, 各引物名称及序列见表 2。

1.3 样品采集、DNA提取和RAPD反应

每株优树取约10 cm长的嫩梢, 标号并捆扎成束, 带回实验室。嫩梢切口处浸水以保湿保鲜。DNA提取参考Doyle和Doyle的CTAB法(Doyle et al., 1990)。

PCR反应在Perkin-Elmer 2400上进行, 采用15 μL反应体系:其中10倍反应缓冲液1.5 μL (100 mmolpH8.3 Tris-HCl, 500 mmolKCl, 20 mmol MgCl₂, 0.01%明胶), Taq聚合酶0.8单位, dATP、dTTP、dCTP和dGTP各100 μmol, 引物0.3 μmol, DNA模板21ng左右。扩增程序为:94℃预变性1 min; 再45个循环:94℃变性30 s, 48℃退火30 s和72℃延伸2 min; 最后再于72℃延伸7 min。扩增产物用含有溴化乙锭的1.0%琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液中电泳分离, 最后在紫外灯下用Polaroid Mp⁴⁺摄像系统照像记录结果。

1.4 数据统计分析

PAPD扩增谱带用1代表出现, 用0代表未出现, 进行统计。利用统计的谱带数据, 参考Nei的方法(Nei et al., 1979)计算优树间的遗传距离(Genetic distance, GD)。对于RAPD数据, 各优树间遗传距离的计算公式为(Excoffier et al., 1992; Huff et al., 1993) :

其中, m_ij为优树i和j共有的谱带数, m为多态性谱带数。相似性指数(The similarity index, SI)则为(1-GD_ij)。

再利用遗传距离数据, 用UPGMA (Unweighted pair group method of arithmetic average)算法(Sokat et al., 1958)进行聚类分析。

2 结果与讨论 2.1 优树间的多态性水平

120个备选引物中, 共筛选出26个重复性好、扩增多态性强、扩增谱带清晰的引物被用于正式扩增(表 2)。RAPD扩增结果表明, 26个引物共产生284条可统计谱带, 谱带长度介于300—3000 bp之间, 表明反应体系和反应程序能对杉木进行有效的RAPD扩增。每引物扩增出的谱带数最少为6条(OPA-07), 最多为15条(OPF-12), 平均10.9条/引物。284条谱带中, 优树间多态性谱带190条, 多态性谱带比例达66.90%, 优树间的多态性水平较高。

由于RAPD方法中, 每个引物都是对整个基因组进行随机扩增(邹喻萍, 1995; 卢江, 1993), 因此所用的26个引物所探测的DNA位点是覆盖整个基因组的, 能对30株杉木优树进行有效的鉴定, 各优树有其特异的RAPD总谱带特征, 即指纹图谱。这表明分子标记对种质资源鉴定的有效性, 也从另一个角度表明研究材料的较高水平的遗传变异。图 1显示了引物OPF-12对30个优树的RAPD扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后的结果。

利用RAPD分析二倍体远交物种的遗传变异时, 有几个因素影响结果的可靠性。1是RAPD为显性标记, 不能检测杂合位点, 可能高估遗传变异的水平(Liu et al., 1993); 2是琼脂糖凝胶分辨度低, 统计的1条RAPD谱带实际上可能是两条或几条长度相近的谱带共分离(Comigrating) (Brummer et al., 1995)所致; 3是所用的RAPD谱带数量(Pejic et al., 1998)。本研究可能高估了收集的优树群体的遗传变异水平, 这有待用共显性的分子标记技术进一步探讨。对于有效的RAPD谱带数量, Pejic等(1998)对几种分子标记技术进行的模拟研究表明, 要使标准差小于5%, RAPD谱带数量至少不少于100条。本研究所用的谱带数量远远大于这个数值, 所得到的结果在一定程度上是可靠的。

2.2 优树间的遣传相似性

研究发现有两株优树(浙江浙01与江西上26)虽然来自不同的省份, 但却具有几乎完全相同的RAPD谱带, 彼此间的遗传相似性极高, 高达91.78%。由此可推断这两株优树最初可能具有相同的起源。另外, 湖南靖21与湖南靖29、安徽西01与安徽黄01以及浙江浙519与浙江浙131的遗传相似性也较高。对遗传相似性极高的育种材料(如浙江浙01和江西上26), 在大批种质资源保存和经营中可以只保存其中1份材料, 这样既可有效保障育种材料的较高的遗传多样性水平, 又可减少费用(Virk et al., 1995)。Virk等(1995)认为, 要在99%的概率上鉴别两个或多个材料是否具有遗传相似性, 至少需要24个引物, 或者86个标记, 或者26个多态性标记。本研究中, 这3个数值分别为26、284和190, 因此对优树遗传相似性的检验是有效的。

2.3 优树间遗传距离和聚类分析

利用统计的30株优树的RAPD位点计算了各对优树间的遗传距离(因数据太多, 未列出)。优树间遗传距离最大为0.6621 (福建洋39与江西上26), 最小为0.0822 (浙江浙01与江西上26), 平均为0.4909, 大多遗传距离在0.45以上。总的来说, 优树间的遗传变异比较大。

根据优树间的遗传距离, 利用UPGMA算法建立了聚类图(图 2)。从图 2可以看出, 单株优树间聚类的遗传距离一般较大, 而各小类间的遗传距离较小, 表明优树群体内个体间包含了丰富的遗传变异。在较大的遗传距离上可以确定不同的值对30株优树进行聚类, 以0.48为临界值, 可以把30株优树分为6类, 来自相同省份的优树多聚一类。但在聚类中也存在个别特殊情况, 如第4类所含的3株优树来自不同的省份, 而第5类只包括1株优树洋33, 这可能与有的个体特别大的遗传变异有关(Castiglione et al., 1997), 从总的聚类结果来看, 这30株优树只有在较大的遗传距离上才能够相对聚在一起, 它们之间的遗传变异程度是相当高的。

2.4 杉木优树遗传变异与杂交亲本选配

本研究中的优树已用于遗传交配设计且子代实验正在进行。本研究对作为亲本的优树进行了分子遗传变异的探索, 将来结合杂交子代的大田表现, 可以进一步探讨分子遗传变异与子代表现的相关。这对分子标记辅助的杂交亲本选配具有重要的意义(Baril et al., 1996; Chowdari et al., 1998), 有关这方面的工作我们已经开展, 并初步获得了一些有价值的结果。