关于松材线虫病(Bursaphelenchus xylophilus)病程中致萎活性物质的研究, 国外学者开展过一些非常有意义的工作。Oku和Shiraishi等(1979, 1981)首先提出, 感病松树迅速枯萎的机制可能是由于毒素的参与。并提取到被称之为“异常有毒代谢产物” (ATM)的低分子量毒素。Bolla, Winter和Shaheen等人(1982, 1984)也发现了低分子量毒素的存在, 并称之为“植物毒素” (Phytotoxin)。但上述研究中的毒性物质都是从自然感病和人工接种的病松树针叶或木材中提取得到, 未能明确这些物质是寄主松树受侵染后被诱发产生的异常代谢产物还是仅为病原线虫的有毒代谢产物, 或是两者皆有。作者在国内首次从致萎毒性物质的角度对该病害的致病机理进行了比较系统的研究, 前期工作已经证明, 包括体外多糖在内的松材线虫代谢产物无致萎活性, 线虫本身不能够直接产生致萎毒素(曹越等, 1996; 1997)。因此, 本试验对我国自然感病的黑松(Pinus thunbergii)和马尾松(P.massoniana)以及人工感病的黑松的木质组织进行萃取、粗提纯和生物测定; 并通过气相色谱—质谱联用仪(GC/MS System)作定性分析。目的是研究有致萎活性的物质在感病松树中产生情况, 探讨与寄主松树代谢过程的关系, 为彻底搞清松树萎蔫的机制提供依据。同时, 对致萎毒素的研究将有助于发现适用于快速检疫方法的特异性物质, 具有重要意义。

1 材料与方法 1.1 供试松树

供试的自然感病黑松(T_E, T_96-A、T₁₀)和马尾松(M_A, M_96-A, M₇)均来自疫区松林, 通过野外观察、采样、贝曼漏斗法分离和镜检确定病死木、感病未死木和健康木。伐回样树后剥去树皮, 用电锯处理成木屑待用。人工接种用黑松(T_R和T_R-CK)在接种前移至温室内盆栽。接种后将发病未死株和对照健康株除去针叶, 用植物材料粉碎机处理成木屑待用。样树选择和处理如表 1所示。

1.2 供试松材线虫

人工接种用的松材线虫采自南京林业大学树木园自然感病的15~20年生黑松, 经贝曼漏斗法分离和表面消毒后培养在玉米粒—Botrytis cinerea培养基上。

1.3 生物测定材料

温室盆播70d生黑松和马尾松幼苗。

1.4 松材线虫的人工接种

采用乳胶管法对3年生黑松进行人工接种。共接种黑松17株, 对照11株。具体步骤如下:

(1) 将单异活体培养的松材线虫用无菌水洗下, 用线虫计数器计测线虫悬浮液的浓度(条/ml)。对照为不含线虫的玉米粒—B.cinerea培养基, 用无菌水作同样处理。

(2) 将黑松的一根枝条剪成斜口, 并在切口处套上一段乳胶管。

(3) 向乳胶管内加入1mL线虫悬浮液(约1×10⁴条), 对照也加入1mL不含线虫的食料真菌悬浮液, 在管口塞少量脱脂棉, 并用透明胶带封口。

(4) 接种完毕的松树及对照置于25℃温室中观察发病情况, 并分离镜检。

1.5 样品水提取液的制备

采用高压蒸煮法(Bolla R et al., 1984)。按W (木屑) /V (蒸馏水) =1/5的比例, 在各样品木屑中加蒸馏水, 在121℃, 10.34×10⁴Pa条件下萃取3h, 收集萃取液。重复一次, 合并两次萃取液, 减压浓缩。自然感病样品分别浓缩至200mL (木屑量3.0kg以下的样品)和400mL (木屑量4.0kg以上的样品)。人工接种的样品, T_R浓缩至60mL, T_R-CK浓缩至50mL。

1.6 样品的提纯

采用氯仿—碱法(Bolla R, et al., 1984)。将样品水提取液用1mol/L的NaOH调到pH=12.0, 并不断添加NaOH使pH=12.0保持1h, 得碱性水提取液。在碱性水提取液中分5次, 每次加入1/8体积的氯仿萃取, 合并5次氯仿萃取液, 以无水硫酸钠脱水, 减压蒸发除去氯仿, 得到干品粗提纯物。

1.7 生物测定 1.7.1 样品水提取液的测定

各样品的水提取液及对照用蒸馏水稀释成1倍和5倍液, 注入小指形管, 分别插入黑松和马尾松幼苗。设重复5~6次, 并另设蒸馏水对照。置于25℃下观察10d, 间隔12h记录一次萎蔫度。最后分别计算黑松和马尾松幼苗在各样品浓度下完全萎蔫的平均d数。

1.7.2 样品粗提纯物的测定

分别将各自然感病松树样品的粗提纯物用蒸馏水配成100mg/kg和500mg/kg两种浓度用于测定。人工感病松树样品仅配制300mg/kg一种浓度。方法与水提取液相同, 但观察时间为15d。对照作同样处理。

1.8 样品提纯物的定性分析

将各样品的粗提纯物溶于1~2mL的三氯甲烷中, 分别用气相色谱—质谱联用仪(GC/MS System)作定性分析。分析条件如下:

仪器型号:5988A GC/MS System

数据处理机:HP59970 MS Chem Station

色谱柱:PH-1型, 25m×0.2mm

柱前压:1kg/cm²

分流比:1:10

载气:氦(He)

汽化室温:250℃

柱温:

进样量:4μL

2 结果与分析 2.1 松材线虫的人工接种结果

接种的17株黑松幼树在35d内发病率为100%, 对照11株均未发病。发病症状表现为:接种枝条的针叶首先退绿, 并逐渐蔓延到其他枝条, 松脂分泌减少。从接种枝条开始针叶下垂枯黄, 植株枯死。样品处理选择在发病后13~15d时进行。此时幼树的一半针叶退绿, 部分针叶下垂枯黄, 处于感病未死的状态, 并已能在主干中检出少量松材线虫。

2.2 生物测定结果

各样品的水提取液和粗提纯物用黑松和马尾松幼苗作生物测定的结果显示, 自然感病的T_96-A和M_96-A的1倍水提取液使两种松苗均在7d内完全枯萎; 5倍水提取液使两种松苗均在10d内完全枯萎。T_96-A和M_96-A的粗提纯物在浓度为500mg/kg时, 使两种松苗均在8d内完全枯萎; 在浓度为100mg/kg时, 使两种松苗均在14d内完全枯萎。人工感病的T_R的1倍水提取液使两种松苗均在5d内完全枯萎; 5倍水提取液使两种松苗均在7d内完全枯萎。T_R的粗提纯物在浓度为300mg/kg时, 使两种松苗均在6d内完全枯萎。除此之外, 自然感病的T_E、M_A及健康对照T₁₀、M₇, 人工感病的健康对照T_R-CK不同浓度的水提取液和粗提纯物在观察天数内均未引起松苗全株枯萎。所有松苗在蒸馏水中均存活良好。T_96-A、M_96-A和T_R使松苗完全枯萎所需的平均天数如表 2所示。

由于只有T_96-A, M_96-A和T_R的水提取液和粗提纯物对松苗表现出致萎活性, 因此, 本次试验表明, 有致萎活性的物质仅存在于感病未死的松树中。

2.3 样品粗提纯物定性分析结果

根据各样品的气相色谱图确定相关的峰后, 经质谱分析及电脑数据库自动检索解析后确定其相应成分。分析结果如表 3所示。

由表 3可见, 得到解析的三种化合物为苯甲醛、苯乙酸和2—甲氧基肉桂酸。其它气相色谱峰虽然也进行了质谱分析, 但未能解析出它们的成分。在已解析出的三种化合物中, 苯乙酸和2—甲氧基肉桂酸仅存在于自然和人工感病未死的松树(T_96-A, M_96-A、T_R)中, 而在病死1年的松树(T_E、M_A)和健康松树(T₁₀, M₇, T_R-CK)中均未发现。苯甲醛在所有样品中均有发现。表明感病松树中产生的有致萎活性的物质与苯乙酸和2—甲氧基肉桂酸有关, 苯甲醛则是松树正常的代谢产物。

3 讨论

关于松材线虫病的致病机制, 目前大多数人认为毒素在致病过程中起有重要作用。Oku等根据接种线虫后松树迅速枯萎这一特点, 首先提出致病过程有毒素参与, 并从感染松材线虫病的黑松、赤松和多脂松的松树针叶和木材中提取出了有致萎活性的物质, 这些物质分别被鉴定为:苯甲酸, 邻苯二酚, 2-氢松柏醇和8-羟基香芹鞣酮(Oku H, et al., 1979; Oku H, 1990);后来Bolla等和Shaheen等又从感病的欧洲赤松(Pinus sylvestris)上分离到了10-羟基马鞭烯酮和8-羟基香芹鞣酮, 经生测后这些物质均有致萎活性(Bolla R, et al., 1984; shaheen F, et al., 1984)。本研究从感病的马尾松和黑松木质组织中, 均提取出了有致萎活性的物质——苯乙酸和2-甲氧基肉桂酸, 这两种物质是以前没有报道的。从松树体内分离并鉴定的有致萎活性的物质共有7种之多, 这些致萎物质的多变性, 可能是所用松树材料不同或分离的时期不同所造成的。

关于致萎物质的来源问题, 一直存在有不同的看法, 作者用松材线虫在各种条件下培养, 均分离不到致萎活性物质, 说明松材线虫本身是不产生致萎毒素的(曹越等, 1996)。目前关于致萎毒素的来源还有两种观点。其一认为受害树体内的有毒物质与线虫携带的细菌有关, Kawazu (1996)分离和鉴定了能产生致萎活性物质的三种芽孢杆菌, 并鉴定出致萎活性物质为苯乙酸, 用苯乙酸处理3年生黑松苗时, 表现和松材线虫致死相同的症状。但后来Tamura等发现, 用无菌的线虫接种同样可以使3年生的黑松发生枯萎, 对细菌的作用产生了怀疑。第二种观点认为, 毒性物质是由于松材线虫的侵染而引发寄主产生的异常代谢产物。Oku根据用不同松树材料或在不同时期分离的毒性物质各不相同这一特点, 推测毒性物质可能是松材线虫侵染松树以后, 诱发松树产生的一些不正常的代谢产物。本研究也支持这一观点, 从感病的松树中提取出的苯乙酸和2-甲氧基肉桂酸均为酚类化合物, 这两种物质也是植物体内重要的次生物质。其中, 苯乙酸为苯基羟酸类, 参与苯基脂肪酸的氧化过程(潘瑞炽等, 1979; 沈同等, 1980); 2-甲氧基肉桂酸属于苯丙烷衍生物, 是木质素的前体, 可进一步形成香豆素、阿魏酸和介子酸以及香豆醇、松柏醇和介子醇, 最后聚合成木质素(Gross G G, 1980; 比德韦尔, 1983)。反映出毒性物质的产生与松树体内的物质代谢过程密切相关。但这一观点还需要进一步证实。

本研究中2-甲氧基肉桂酸的检出具有特殊的意义。肉桂酸由植物莽草酸途径中苯丙氨酸解氨酶(PAL)催化L—丙氨酸脱氢形成。它是香豆素、黄酮、类黄酮、黄烷酮等化合物的代谢前体。这些化合物是多种植物保卫素的主要成分(章元寿, 1996)。同时, 肉桂酸又属于酚类抑制剂, 由于病原物侵染而增加或病原物诱导产生, 而一些酚类抑制剂对寄主具有很强的毒性(庞士铨, 1990)。因此, 在感染松材线虫的松树体内, 肉桂酸的增多可能与植物抗性物质的合成有关。Bolla等(1984)就曾认为, 迁移型线虫侵染点处植物保卫素的产生已被证实, 如果合成继续, 植物保卫素就可能积累到对植物有害的程度。