松毛虫质型多角体病毒(DsCPV)是我国重大森林害虫———松毛虫的重要致病微生物, 它对松毛虫幼虫感染力强, 致死率高, 对人、畜及天敌昆虫安全, 尤其是其可通过感病幼虫的排泄物或尸体进行水平扩散, 通过产卵进行垂直传递, 对松毛虫灾害具有良好的持续控制效果(陈昌洁等, 1988), 生产中, 使用过DsCPV杀虫剂的林区, 可长达数年不发生松毛虫灾害。几十年来我国科技工作者对利用DsCPV防治松毛虫进行了大量的研究, 并作为一种有效的生物杀虫剂在我国松毛虫灾害的综合治理上起到了非常重要的作用。科学地认识和评价DsCPV病毒在松毛虫种群中的垂直传递能力及其对松毛虫灾害的持续控制效果, 对进一步发挥DsCPV杀虫剂在松毛虫灾害治理中的作用具有重要的意义。利用PCR技术可以灵敏地检测出感病虫体内存在微量的病毒遗传物质, 可以用来研究DsCPV病毒使用后林间松毛虫种群的带毒状况, 从而进一步研究DsCPV对松毛虫的持续控制效果。

昆虫质型多角体病毒(CPV)属于呼肠孤病毒科质型多角体病毒属, 寄主范围仅限于非脊椎动物的昆虫纲。CPV病毒为dsRNA病毒, 其基因组由10个等分子数的dsRNA片段组成。CPV病毒的分类, 目前暂时地以其基因组dsRNA片段在1 %琼脂糖凝胶电泳上迁移图谱类型的变化做为依据(Payne et al., 1976;Mertens et al., 1989);根据这个标准, 已经确定了至少12个不同的CPV病毒电泳型。

CPV病毒的多角体蛋白在保护稳定病毒粒子的生物活性及识别侵染受体细胞过程中起着重要的作用。CPV病毒编码多角体蛋白的基因位于其dsRNA基因组最小的dsRNA片段上, 目前已有家蚕CPV病毒(BmCPV)、棉铃虫CPV(HaCPV)病毒等数种CPV病毒多种分离株的多角体蛋白基因被克隆和测序。研究表明, CPV病毒多角体蛋白基因的核苷酸序列, 在不同的电泳类型之间没有明显的同源性(Fossiez et al., 1986;Galinsk et al., 1994;Arella et al., 1988), 但同一电泳型的不同CPV, 其多角体蛋白基因的同源性程度很高, 如同为Type 5的Heliothis armigera CPV (HaCPV)、Orgyia pseudotsugata CPV(OpCPV)和Euxoa scandens CPV (EsCPV), 它们多角体蛋白基因核苷酸序列的同源性程度可达98%(Galinsk et al., 1994)。

DsCPV, BmCPV, LdCPV同为Type 1病毒, 它们的基因组核苷酸序列也具有非常高的同源性(Payne et al., 1978)。由于DsCPV目前还没有任何基因序列资料报道, 本文依据已发表的BmCPV病毒多角体蛋白基因的核苷酸序列资料设计合成寡聚核苷酸引物, 建立DsCPV病毒的RT-PCR检测技术, 现将结果报道如下。

1 材料和方法 1.1 病毒材料

DsCPV病毒, 于1986年复制, 低温冰箱保存。BmCPV病毒, 由中国科学院动物研究所蔡秀玉提供。LdCPV病毒、HaCPV病毒、LdNPV病毒均为本研究室保存材料。

1.2 病毒基因组核酸的提取与纯化

CPV病毒和NPV病毒多角体的提取与纯化采用陶粮(1988)的方法, CPV病毒基因组dsRNA的提取与纯化, 采用Payne的热酚法(Payne et al., 1976);NPV病毒基因组核酸的提取与纯化采用刘润忠(1998)的方法。

1.3 松毛虫幼虫中肠组织核酸的提取与纯化

松毛虫幼虫中肠组织核酸的提取与纯化采用祁学忠(1996)方法。

1.4 RT-PCR扩增反应

依据已发表的BmCPV dsRNA基因组第10片段的核苷酸序列资料(Nacazawa, 1996), 设计合适的RTPCR扩增引物。上游引物20bp, 位于其5′端从193bp到213bp, 下游引物20bp, 位于786bp到806bp之间的序列, 两引物的核苷酸序列分别为:5′TCAACAAGAACTCGCAATAC 3′和5′TCCAAGTTACACGAGCAATC 3′。所有模板的RT-PCR扩增反应, 均使用Promega公司的Access RT-PCR System试剂盒, 但方法有改动。取2μL模板核酸溶液, 100 ℃沸水浴10min后立即置于冰上; 加入酶反应混合液(上下游引物各2μL, AMV Reverse Transcriptase和Tfl DNA Polymerase各1μL, AMV Tfl 5 ×Reaction Buffer 10μL, 25mM MgSO₄2μL, dNTP Mixture 1μL), 总反应体积50μL。混合均匀后上面覆盖约50μL的矿物油(分子生物学级别)。置于PCR仪上, 依下列程序进行RT-PCR扩增反应:45 ℃90 min进行反转录, 然后PCR扩增循环:94 ℃40 s, 56 ℃1 min, 72 ℃1 min, 循环35次后, 72 ℃进行延长反应7 min。取5μL反应物于1%琼脂糖凝胶电泳上EB染色检测。

1.5 序列测定

得到的PCR产物精制后送宝生物工程公司进行双向测序。结果见图 2。

2 结果与分析 2.1 DsCPV病毒dsRNA基因组的RT-PCR检测

根据BmCPV dsRNA基因组第10片段的核苷酸序列设计合成引物, 对DsCPV的基因组dsRNA进行RT-PCR扩增的结果如图 1所示, 在约600bp处有一条清晰的带, 与预期结果相符; 所得DNA扩增片段的核苷酸序列测定结果表明, 共有614个碱基, 也与理论值相同(图 2)。与BmCPV dsRNA基因组第10片段的核苷酸序列相比, 此片段为其5′端从193bp到806bp之间的碱基序列, 属基因内部序列, 不包含任何非编码区的碱基。与BmCPV多角体蛋白基因的相应片段的序列同源性比较显示, 同源性程度为87 %, 不同的核苷酸碱基有78处。

2.2 RT-PCR检测DsCPV的特异性鉴定

分别以DsCPV、BmCPV、LdCPV、HaCPV和LdNPV病毒的基因组核酸, 以及虫体细胞染色体基因组核酸为模板, 经RT-PCR反应, 结果显示, 以DsCPV、BmCPV和LdCPV病毒的基因组核酸为模板, 根据BmCPV基因组第10片段序列设计合成的引物成功地扩增出长614bp的特异性产物, 而HaCPV、LdNPV病毒的基因组核酸、虫体细胞染色体基因组核酸及无模板RT-PCR反应, 均未检出目的扩增片段(图 3)

2.3 RT-PCR检测DsCPV的敏感性鉴定

将纯化的DsCPV病毒基因组核酸溶液浓度调整至1μg/mL, 按1:10系列分别稀释为1×10^-1μg/mL, ×10^-2μg/mL, 1×10^-3μg/mL, 1×10^-4μg/mL和1 ×10^-5μg/mL; 各取1μL做模板, 无模板核酸反应做阴性对照, 结果见图 4。以1μgL的1 ×10^-3 μg/mL浓度的DsCPV基因组核酸溶液(1pg)做模板, 仍可见明显的特异扩增带。

3 讨论

不同种类的NPV病毒, 其多角体蛋白基因的核苷酸序列具有极高的同源性, 但不同种类的CPV病毒、及CPV病毒与NPV病毒之间, 多角体蛋白基因序列没有明显的同源性(Fossiez et al., 1986;Galinsk et al., 1994;Arella et al., 1988)。不过同一电泳类型的CPV病毒之间, 其多角体蛋白基因的同源性程度也很高, 如同为Type5的Heliothis armigera CPV(HaCPV)、Orgyia pseudotsugata CPV(OpCPV)和Euxoa scandens CPV(EsCPV), 它们多角体蛋白基因核苷酸序列的同源性程度可达98%(Galinsk, 1994)。Payne C C.et al.(1978)以同源杂交的方法研究报道了同为Type 1类型的BmCPV、DsCPV和LdCPV病毒之间基因组核酸的同源性, 结果显示DsCPV和LdCPV之间没有明显的不同, 两者与BmCPV的同源性为52%~76%。本研究根据BmCPV病毒多角体蛋白基因序列设计合成的引物, 对DsCPV病毒和LdCPV病毒的基因组核酸进行RT-PCR反应, 均可成功地扩增出长614bp的特异性目的产物, 也证实了同样的事实; 对DsCPV病毒的基因组核酸进行RT-PCR反应所得DNA扩增片段的序列分析表明, DsCPV病毒与BmCPV病毒, 其多角体蛋白基因核苷酸序列的同源性为87 %, 但明显低于不同种类的NPV及CPV与NPV之间多角体蛋白基因序列的同源性程度。

松毛虫、家蚕、舞毒蛾, 属不同类型的林业害虫, 相互之间食性不同, 分别取食为害不同的树种; 且BmCPV病毒和LdCPV病毒对松毛虫无感染性, 即在松毛虫体内不会有BmCPV病毒和LdCPV病毒的感染, 因此利用本方法对松林间松毛虫种群中DsCPV病毒感染的检测研究时, 可以不考虑BmCPV病毒和LdCPV病毒感染的可能性。

本文建立的RT-PCR检测方法, 对DsCPV病毒进行检测的敏感度为1pg含量的DsCPV病毒基因组核酸。综合以上所述, 表明本文建立的RT-PCR检测技术方法对DsCPV病毒是敏感而特异的, 可用于松林间松毛虫种群中DsCPV病毒感染的检测研究。而且, 由于本方法也可扩增BmCPV病毒和LdCPV病毒的多角体蛋白基因的片段, 因此也可用于BmCPV病毒和LdCPV病毒的有关研究。