毛白杨有性生殖能力较低, 在其自然分布区内, 雄株虽多, 但花粉败育严重, 有的甚至无花粉; 雌株较少, 结籽能力差。毛白杨配子败育原因的研究较少, 而且大都是依据杂交试验和形态解剖观察得出的推测结果(徐纬英, 1960; 陈跃华, 1979; 董源, 1982)。本文采用细胞遗传学的方法, 从细胞乃至染色体水平就毛白杨花粉败育机制进行了研究。

实验材料采自山东冠县毛白杨无性系花枝标本园。1995年选用了18个毛白杨(P.tomentosa)雄性无性系, 即B101 (北京)、B102~B104 (河北)、B105 (山东)、B106~B107 (河南)、B108~B110 (山西)、B111~B115 (陕西)、B116~B117 (甘肃)、B118 (安徽)等; 1997年, 由于B101、B105、B107、B109无性系丢失, 选用了其余的14个无性系。每年1月初采集所需雄花枝, 运回温室水培, 用于收集花粉和花粉母细胞减数分裂观察。

花粉母细胞减数分裂观察:当毛白杨花枝于温室内水培约20 h后, 每隔2 h用卡诺固定液固定几个花芽, 并制片跟踪观察, 直至减数分裂进行到4分体时停止固定。采用醋酸洋红压片法观察减数分裂终变期、中期Ⅰ的染色体联会情况, 以及后期Ⅰ、末期Ⅰ的染色体行为等。每个无性系的每个观察项目均固定3个花芽, 取其中有代表性花芽的中部小花制2~3张玻片, 并分别观察50个典型的中期Ⅰ、后期Ⅰ分裂相, 30个典型的终变期、末期Ⅰ分裂相, 统计每个细胞中的单价体或落后染色体数目等, 并计算其中每个时期含单价体或落后染色体细胞的百分率。

花粉育性观察:在花芽撒粉后, 分无性系单独收集花粉, 电子天平称量统计每序花粉产量; 同时用光学显微镜观察3~5张花粉临时涂片, 每片5个视野, 统计花粉中的空瘪、无核等败育花粉百分率。

雄性不育的原因不外乎遗传与环境这两种因素, 其中遗传因素主要有两种, 即染色体不平衡和遗传不平衡(李竞雄等, 1993; 孟金陵, 1995)。在毛白杨种群中, 染色体不平衡主要包括染色体数目变异和染色体结构变异, 即天然三倍体植株(图版Ⅰ, 3~4)和染色体倒位、易位等(图版Ⅰ, 5~7)。但相对整个毛白杨种群而言, 属于染色体不平衡的个体毕竟只是少数, 遗传上的不平衡才是毛白杨花粉败育的主导因素。

图版Ⅰ   Plate Ⅰ   1~ 2.毛白杨的无核、空瘪败育花粉。3~ 7.毛白杨染色体数目和结构变异(3~ 4.天然三倍体无性系B329、B332的染色体数:2n=3x =57;5.倒位桥; 6~ 7.易位环和易位四体链)。8~ 11.毛白杨减数分裂的染色体行为异常(8.中期Ⅰ :示单价体; 9~ 11.后期Ⅰ、末期Ⅰ、后期Ⅱ :示落后染色体)。12.染色质凝聚的花粉母细胞(或孢原细胞)。 1~ 2.The sterility pollens of nuclearless and shrivelled in Chinese white poplar.3~ 7.The chromosomal number and structrual variations(3~ 4, chromosomal number of triploidy clones B329、B332:2n=3x=57;5.chromosomal inversion; 6~ 7.chromosomal translocations).8~ 11.The chromosomal abnormal behavior in meiosis of ollen mother cells(PMC)in Chinese white poplar(8. Metaphase Ⅰ :showing univalents; 9~ 11.Anaphase Ⅰ, Telophase Ⅰ, Anaphase Ⅱ :showing laggards chromosome).12.PMC or sporogonium of chromatin agglutination.

从18个毛白杨雄株的花粉母细胞减数分裂中的染色体联会行为观察看(表 1), 终变期的联会大多成为环状二价体, 偶有2~4个单价体的出现, 单价体的出现频率因个体不同变动于0 %~20 %之间。而在中期Ⅰ分裂相中, 单价体的数目增多, 且因个体不同而有所差异(图版Ⅰ, 8), 其中, B102、B105出现最少, 仅为2~4个, B108出现单价体数最多, 达到2~18个; 其出现频率介于38%~94%之间。这种联会较差单价体的出现是遗传上不平衡的结果, 显示了毛白杨的同源染色体间存在着一定程度的异质性。

众所周知, 由于遗传上的不平衡, 在中期Ⅰ所表现出的同源性较差的染色体, 在后期Ⅰ、末期Ⅰ往往会有异常的表现(图版Ⅰ, 9~11)。从表 1可知, 在18个毛白杨雄株的花粉母细胞减数分裂后期Ⅰ均有落后染色体的出现, 且因个体不同而变动于2~12条之间, 其出现的频率也比较高, 最高可达100%, 最低也有48.0%。甚至在减数分裂末期Ⅰ时, 赤道板附近仍有单独的落后染色体存在, 但相对于后期Ⅰ而言, 落后染色体数目较少, 一般为2~8条, 其中有2~4个单价体在末期Ⅰ和末期Ⅱ时经常出现, 最终在部分细胞中未被包含于末期的核内, 从而滞留于赤道板附近的细胞质中形成往往会随着减数分裂过程的进行而丢失, 使子核内染色体数少于19, 缺失了具功能染色体的配子当然是很难存活或良好发育的。

表 1 毛白杨减数分裂过程中的染色体行为表现 Tab.1 The chromosome behavior during meiosis of pollen mother cell in Chinese white poplar

表 1 毛白杨减数分裂过程中的染色体行为表现 Tab.1 The chromosome behavior during meiosis of pollen mother cell in Chinese white poplar

毛白杨花粉败育主要表现在两个方面, 即不同植株间存在着花粉量的差异以及产粉植株存在一定比率的空瘪、无核等败育花粉等(图版Ⅰ, 1~2;表 2; 图 1)。对1995年毛白杨18个雄株的每序花粉量、花粉中败育花粉百分率与减数分裂后期Ⅰ含落后染色体分裂相百分率的相关分析表明相关显著, 相关系数为r₁=-0.6445 (r_0.01=0.5614), r₂=0.6759 (r_0.01=0.6055)。由此可见, 花粉败育的原因之一是染色体异源性造成的遗传上的不平衡, 进一步引发了复杂的减数分裂过程和染色体行为发生偏差, 由于个体间遗传组成的差异, 就造成了毛白杨不同个体的一定比率分不正常发育或死亡。

表 2 毛白杨不同雄性无性系花粉败育情况及年度差异 Tab.2 The difference in pollen abortion of various male clones for Chinese white poplar in different years

表 2 毛白杨不同雄性无性系花粉败育情况及年度差异 Tab.2 The difference in pollen abortion of various male clones for Chinese white poplar in different years

然而, 如果此时假设异源性造成的同源染色体向子细胞不均衡分配是毛白杨配子败育的唯一原因的话, 那么雄性植株撒粉量的多少与空瘪败育花粉的百分率之间应当存在一定的相关关系, 但实际上这种相关是非常小的, 相关系数r₃=-0.2775 (r_0.01=0.6055)。而且我们知道, 即使是染色体分配极不均衡的三倍体也可以产生一定量的花粉(康向阳等, 1999), 况且正常情况下的毛白杨雄花序可产生花粉的数量是巨大的, 从概率论而言, 即使染色体分配极不均衡, 也应该或多或少产生一定量的可育花粉及空瘪花粉等, 而象B103、B108、B116等植株那样不产生花粉则是违反常理的。这说明上述假设不成立, 即在毛白杨有性生殖过程中, 除了染色体不均衡分配造成配子中丢失具功能的染色体这一因素之外, 还有其它原因或相关原因存在。

有关资料表明, 在进行过环境敏感性试验的雄性不育材料中, 约有70%的不育性表现对环境敏感, 其中许多异质杂交种的雄性不育常因栽培条件不同表现出不稳定性(孟金陵, 1995)。Kkberg等(1967)曾在瑞典对欧洲落叶松(Larix decidua)、日本落叶松(L.beptolepis)、西伯利亚落叶松(L.sibirica)进行了连年花粉观察, 发现不育花粉百分率对温度有明显的依赖关系。这一结果与毛白杨育性的不稳定有一定相似性。徐纬英(1968)曾进行了气温对毛白杨花芽发育影响的研究, 认为花粉败育的产生可能是毛白杨完成温期阶段后降低了抗寒力所致。董源(1982)亦认为低温条件可诱导毛白杨雄性不育。而从对相同栽植地点两年毛白杨花粉观察结果看, 不同产地的不同无性系在年度间花粉育性表现出较大的差异(表 2), 其中在花粉量方面, 同一无性系在不同年度差异较大, 最高为B114, 年度相差达30.0mg/序; 而在败育花粉百分率方面, 无性系年度间相差最大是B113, 达28.1%。这种花粉败育的年度不稳定性现象的存在, 表明环境因子对毛白杨花粉发育的确有一定的影响。

在研究中发现, 毛白杨雄花序的撒粉量与其孢母细胞减数分袭所用时间, 特别是与自水培至终变期所经时间有显著的相关关系, 相关系数达r₄=-0.7985 (r_0.01=0.5614), 这表明毛白杨雄花芽在减数分裂终变期之前的发育时期对花序的产粉量有较大的影响。在毛白杨小孢子发生过程中, 至少观察到如下两种异常现象, 其一是在各无性系中均可观察到约0.1%~0.5%染色质凝聚(chromatin agglutination)的花粉母细胞(或孢原细胞) (图版Ⅰ, 12), 花粉母细胞(或孢原细胞)细胞质液泡化, 核结构破坏, 核仁、染色质与胞质凝结成团, 最后导致败育的现象在水稻、小麦不育系等植物中多有报道(孟金陵, 1995; 欧阳丰, 1993)。这是由于异质性的基因组成阻碍花粉母细胞的发育, 染色体解体或发生凝集, 大多在未进入减数分裂前便液泡化而解体, 我们所观察到的只是其中少量尚未发生解体的花粉母细胞(或孢原细胞)。其二是绒毡层解体提前, 在减数分裂进程较慢雄株的前期Ⅰ, 还可观察到有大量绒毡层细胞从药壁上脱落下来, 其中有的大于正常细胞, 有的呈不规则形状; 细胞质较淡, 核不易着色, 甚至解体。尽管这种情况在18个无性系雄株中表现不一, 但基本有一个趋势, 即该现象越严重, 所能见到的花粉母细胞减数分裂前期Ⅰ的分裂相就少, 最终花粉量也就越少, 甚至无花粉。显然, 毛白杨异质性遗传基础的作用几乎涉及了小孢子形成的整个过程, 由于异质性的基因型及其与外部气温等环境因子的相互作用, 导致花粉母细胞(或孢原细胞)和绒毡层细胞等发育异常, 由此而产生的“后滞效应”在减数分裂继续表现, 造成花药提前萎缩干瘪, 产粉较少, 甚至不产粉, 这也是毛白杨花粉败育(主要是花粉量)的主要原因。

总之, 毛白杨花粉败育就是其异质性遗传基础与环境相互作用的结果。在减数分裂终变期以前, 主要是在花粉母细胞时期或其形成之前, 可能有一个或几个阶段, 毛白杨花芽组织对温度等环境因子变化较为敏感, 当温度等环境因子变化超过一定值(不一定是剧烈变化)时, 异质性的基因型与环境相互作用, 导致某些花粉母细胞(或孢原细胞)和绒毡层等花药组织发生异常甚至受到损害, 这种异常或损害在毛白杨花粉母细胞进行减数分裂时会逐渐表现, 从而产生花粉量与减数分裂至终变期所用时间显著相关等现象。其中花粉母细胞或孢原细胞的异常会直接引起花粉败育, 而绒毡层等花药组织的异常, 则会使绒毡层细胞与发育中的小孢子或花粉之间的信息、物质交流发生紊乱, 花粉形成过程中必需的营养物质合成、传递受阻, 最终亦间接造成花粉败育, 甚至完全不育。由于毛白杨不同基因型在减数分裂终变期之前对温度等环境因子敏感程度的差异, 以及各无性系对温度敏感的发育阶段与环境因子变化相耦合的情况不同, 相应造成对花粉母细胞(或孢原细胞)和绒毡层细胞损害程度的差异, 从而导致花粉败育的年度不稳定性。同时与减分裂中染色体不均衡分配和染色体结构变异(易位、倒位)等造成的花粉败育相累加, 最终决定了毛白杨当年不同雄性无性系的花粉败育情况, 即形成花粉量和败育花粉百分率的差异。此外, 毛白杨天然三倍体株系的存在也是经常观察到配子败育的原因之一。