银杏原产我国, 是当今地球上最为古老的植物之一, 为我国二级保护植物。其种仁和叶具有极高的药用价值。它是目前经济价值最高、效益最好的经济树种和首选的庭园绿化树种, 在学术上也有很高的研究价值。因此, 开展银杏种质资源保存具有极为重要的现实意义。一些银杏产区已营建了银杏种质资源圃(郭善基, 1993), 但这种保存方法占地面积大, 花工多, 且易受各种自然灾害的侵袭而失去要保存材料的危险。

超低温保存是在现代生物技术和低温生物学基础上发展起来的。自1973年Nag和Street首次报道在液氮中成功地保存了胡萝卜细胞后, 植物种质超低温保存技术因其不仅能长期保持细胞生物学特征, 而且还具有大大减少传统的植物种质资源保存过程中所需的大量人力、物力、时间, 并保证材料无病、虫、毒等的侵入, 便于运输等优点, 开始倍受植物界的关注。业已证实, 超低温保存植物种质是可行的(Villablobos et al., 1995; 徐刚标, 2000)。但在乔木上研究应用不多(徐刚标, 2000)。本文首次对我国特有、珍贵的多用途经济树种银杏开展这方面研究, 旨在为银杏种质保存开辟一条新途径, 同时也为超低温技术在树木保存上应用研究提供理论和方法学参考。

1 材料与方法 1.1 实验材料

用中南林学院经济林研究室选育出的湖南梅核I号银杏类型, 用其成熟胚的子叶诱导出的愈伤组织为实验材料。

1.2 实验方法 1.2.1 银杏愈伤组织诱导与继代培养

银杏愈伤组织诱导与继代培养按徐刚标等提供的方法(徐刚标等, 1999)。诱导培养基为MS+NAA2.0 mg·L^-1+BA2.0 mg·L^-1+蔗糖3 %, 继代培养基为MS+NAA2.0 mg·L^-1+ZT2.0 mg·L^-1+Vc5.0 mg·L^-1+蔗糖3 %。

1.2.2 银杏愈伤组织超低温保存

冰冻保护剂筛选  本实验参考前人研究工作(路铁刚等, 1995; 孙龙华等, 1990; 郑光植等, 1983; 殷晓辉等, 1996; Erica, 1994; Jain et al., 1996; Norgaard et al., 1993; Reinhoud et al, 1995; Yamada et al., 1993), 共设计8种冰冻保护剂。除二甲基亚砜(DMSO)外, 各类冰冻保护剂先溶于1/2MS培养基大量元素培养液中, 于105 ℃高温高压灭菌10 min, 无菌条件下加入二甲基亚砜。

冰冻保护剂加入  选择首次继代培养21d的银杏愈伤组织(200 mg)放入有刻度的10 mL试管中, 分两组实验。一组在室温下加入冰冻保护剂, 另一组在冰浴上加入预冷至0℃左右的冰冻保护剂, 处理时间均为1 h。

预培养  将愈伤组织接种在含蔗糖、山梨醇、脯氨酸、甘露醇、海藻糖等高渗物质的继代培养基上, 预培养2 d。

预处理  在冷库(4 ℃)里预处理45 min~1 h。

化冻、洗涤及细胞存活力测定  细胞活力测定参考文献介绍的方法(Erica, 1994)。称取银杏愈伤组织200 mg, 加入5 mL TTC试剂, 在22 ℃~25 ℃, 黑暗中静置18~20 h, 倒去TTC液, 蒸馏水洗涤2~3次, 然后加入5 mL 95 %的乙醇, 60 ℃水浴中处理25 min, 用751分光光度计在485 nm波长处测试提取液的吸收值(TTC值)相对值, 并用其表示细胞活力。

再培养  化冻洗涤后的愈伤组织, 立即接种到继代培养基中, 于24 ℃暗培养。

2 结果与分析 2.1 冻保护剂毒性

本项研究试验共选用8种冰冻保护剂, 分别在室温和冰浴上加入。结果表明, 在室温下加入各冰冻保护剂都在不同程度上对银杏愈伤组织具有毒害作用, 而在冰浴上加入, 各冰冻保护剂对细胞毒性大大地缓轻, 甚至没有表现出与对照之间TTC值差异。两种处理方法都表现出复合冰冻保护剂比单一冰冻保护剂对细胞毒性小, 其中室温下处理更为明显。在同一处理方法, 同一冰冻保护剂不同重复间TTC值也有较大的差异。我们认为, 这可能与银杏愈伤组织本身的生理活性异质性有关。表 1是3次重复试验的平均值。

2.2 冰冻保护剂对银杏愈伤组织保存效果的影响

以1 ℃·min^-1的降温速度从4 ℃降温, 在-15 ℃和-35 ℃分别停留10 min和30 min后, 投入液氮中。贮藏1 d后取出, 在40 ℃水浴中快速化冻, 室温下用洗涤液洗涤2次, 然后测试TTC值, 结果见表 2。从表 2中可看到10 %二甲基亚砜+8 %水解乳蛋白及10 %二甲基亚砜+0.5 mol·L^-1山梨醇保存效果最好, 平均相对存活率分别为45.8 %和46.4 %; 10 %二甲基亚砜+10 %蔗糖、10 %二甲基亚砜+8 %葡萄糖+10 %聚乙二醇及10 %的二甲基亚砜+8%的葡萄糖次之, 平均存活率分别为37.5%、34.8%、35.5%;而含甘油的3种保护剂效果最差。

将冰冻后的愈伤组织接种到新鲜的继代培养基上, 除了10 %二甲基亚砜+8 %水解乳蛋白处理的材料变褐外, 其它材料均能生长, 但生长速度十分缓慢。由于样品数量少, 未定期测量鲜重生长量。

2.3 预培养对银杏愈伤组织保存效果影响

将愈伤组织继代在含山梨醇、脯氨酸、甘露醇、海藻糖等高渗物质的MS培养基上预培养2 d后, 在冰浴上加入10 %二甲基亚砜+0.5 mol·L^-1山梨醇, 在冰浴上保持45 min, 然后以1 ℃·min^-1的降温速度从4 ℃降至-15 ℃、停留10 min, 仍以1 ℃·min^-1速度降到-35 ℃, 停留30 min, 最后投入液氮。1 d后取出, 40 ℃化冻洗涤, 测定TTC值。结果发现(表 3), 在含高浓度甘露醇、山梨醇的MS培养基上预培养2 d的银杏愈伤组织超低温保存后的TTC值得到提高, 而海藻糖、脯氨酸预培养处理效果次之, 蔗糖似乎效果不明显。这表明, 预培养处理可提高分裂相细胞的比例和减少细胞内自由水含量, 增强了愈伤组织细胞抗寒能力。关于不同高渗物质处理造成冰存后细胞的TTC值差异, 是由于材料本身特性, 还是由于重复次数太少(仅重复3次), 有待进一步研究。

2.4 降温处理

本研究实验共设计了7种降温程序, 研究结果见图 1。程序Ⅲ和Ⅴ是一种较理想的冰冻方式, 即以1 ℃·min^-1或0.5 ℃·min^-12种速度降温, 在-15 ℃停留10 min, -35 ℃停留30 min后, 再投入液氮中保存。这两种程序对银杏愈伤组织而言, 不管其是否经过预培养处理, 在其它条件相同的情况下, 冻存后的存活率都是最高的。经程序Ⅲ降温, 预培养处理和未经预培养的银杏愈伤组织冻后平均相对存活率分别为52 %和39 %; 经程序Ⅴ降温, 预培养处理和未经预培养的愈伤组织冰存后平均相对存活率分别为50 %和32 %。降温速度过大或过小, 均不利于保存后的愈伤组织存活, 平均相对存活率分别在12 %~41 % (预培养)和9 %~23 % (未预培养)之间。这说明, 银杏愈伤组织超低温保存的最适宜降温速度为0.5~1.0 ℃·min^-1。这可能是在此降温速度下, 银杏愈伤细胞达到了良好脱水状态, 既避免了快速降温时细胞来不及脱水而形成细胞内冰晶, 又防止了由于降温速度过小导致细胞内溶质浓度过高、时间过长引起的“溶液效应”。

3 讨论

许多植物组织和细胞超低温保存过程中, 常常需要加入冰冻保护剂。作为冰冻保护剂应具有高溶解度及对细胞低毒性, 化冻后易从组织、细胞中清洗掉, 其中二甲基亚砜和糖醇类物质是首选保护剂(殷晓辉等, 1996; Erica, 1994)。本项研究证实了前人的研究结论。同时还表明, 复合冰冻保护剂比单一的冰冻保护剂对银杏愈伤组织、细胞毒性小, 在冰冻保存过程中对细胞的保护效果好。这可能是, 二甲基亚砜属于渗透性保护剂, 而糖醇类物质属非渗透性保护剂, 它们具有相同的保护效应而各自产生的毒性机理不同。因此, 混合使用时, 保护效应增加而毒性反而降低, 甚至相互抵消。

银杏愈伤组织超低温试验之前, 在高渗透压的培养基上预培养处理显得较为重要, 但不同高渗化合物对银杏愈伤组织抗寒能力的提高程度不一样, 其中, 以在含有山梨醇、甘露醇的MS培养基上预培养的愈伤组织超低温保存效果最好。这和某些培养物超低温保存预培养要求基本一致(Norgaard et al., 1993; Reinhoud et al., 1995; Yamada et al., 1993; Villalobos et al., 1995)。

一些研究认为(路铁刚等, 1995; 孙龙华等, 1990; 殷晓辉等, 1996; 郑光植等, 1983), 慢冻材料降温至某一温度停留一段时间是必要的。本次研究实验也表明, -10 ℃和-35 ℃处停留一段时间明显地提高冰存后银杏愈伤组织的相对存活率。这可能是, 中间停留有利于细胞外冰晶形成和生长, 使细胞达到保护性脱水, 以防止细胞在下一步降温过程中因细胞内水来不及排出而结冰, 从而导致细胞膜结构不可逆性损伤。

相对而言, 本次研究实验中银杏愈伤组织保存后的存活率比有关报导的结果要低一些。我们认为有两方面原因:一是由材料本身的生理、遗传特征决定; 二是与银杏愈伤组织细胞类型不一致有关。光学显微镜下可观察到银杏愈伤组织细胞有球形、长圆形和长条形等几种类型, 不同类型细胞的大小及内含物、液泡都不一样, 因此, 抗冻能力及所需的最适宜降温速度可能也不一样, 保存后的材料可能仅是其中部分液泡小的细胞存活。