密环菌属[Armillaria (Fr.:Fr.) Staude]是一类非常重要的林木病原菌, 它的寄主范围广, 培养特征和担子果形态变异大。由它引起的红松和落叶松根朽病近年来在中国东北普遍发生, 对人工用材林和母树林的危害甚大。从Kari Korhonen (1978)首次发现蜜环菌生物种以来, 生物种已成为系统分类的基础, 根据生物种建立的分类种, 已被菌物分类学和森林病理学界广泛承认。目前生物种的研究不仅是森林病理学上鉴定病原菌和按病原分类施策的必要前提, 也是蜜环菌药用发酵和天麻猪苓栽培等方面的基础。迄今欧洲、北美、澳洲、非洲和日本等国学者均按生物种标准鉴定了各自地区的蜜环菌种类(Shaw et al., 1991;Korhonen, 1995)(Shaw et al., 1991;Korhonen, 1995)。我们也初步鉴定了中国东北和西南地区的8个蜜环菌生物种, 称为中国生物种(Chinese Biological Species, CBS), 通过交配鉴定了CBSA、CBSB、CBSD和CBSI分别为芥黄蜜环菌[A.sinapina Bérubé & Dessur.]、高卢蜜环菌[A.gallica Marxm.&Romagn.]、奥氏蜜环菌[A.ostoyae (Romagn) Herink.]和假蜜环菌[A.tabescens (Scop.) Emel](贺伟等, 1996;秦国夫等, 2000)(贺伟等, 1996;秦国夫等, 2000)。

鉴于蜜环菌的一切遗传、生理和生态学研究都必须建立在遗传多样性研究基础之上, 因此, 在生物种基本得到澄清之后, 其种下遗传变异已成为各国菌物学家关注的问题, 其目的是通过DNA分子定型来快速鉴别蜜环菌的生物种, 从而避免繁琐的单孢分离和遗传测交技术; 二是通过分子系统学研究, 为探讨全球各生物种之间的起源和演化, 特别是种间界定提供更全面的依据。作为前者, Harrington (1995)在Anderson (1992)的蜜环菌分子系统学研究的基础上发展了IGS的PCR-RFLP鉴定方法(Harrington et al., 1995;Anderson et al., 1992), 此后, Banik等(1996,1998)、Volk (1996)、Terashima (1998)、White (1998)、Sierra (1999)等都用该方法进行了生物种的鉴定(Banik et al., 1996;1998;Volk, 1998;Terashima et al., 1998;White et al., 1998;Sierra et al., 1999)。在生物种内的地理遗传多样性研究方法, Coetzee等(2000)对全球的蜜环菌[A.mellea s.str.]进行了IGS和ITS的DNA序列分析, 发现了该种存在亚洲、欧洲、东北美和西北美4个独立的进化群体(Coetzee et al., 2000)。Schulze (1997)用rDNA-RFLP和RAPD方法发现奥氏蜜环菌在欧洲只有较低的遗传变异(Schulze et al., 1997)。为揭示另一个北半球性分布的高卢蜜环菌的地理变异情况, 进而对其进行分子鉴定, 我们进行了欧、亚、美3个大陆高卢蜜环菌菌株IGS和RFLP以及RAMS分析, 现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 菌种与培养

23个高卢蜜环菌的单孢菌株来自欧洲、亚洲和北美的6个国家(表 1)。将菌种接种培养在cellophane膜表面上, 膜下为含有2%麦芽粉、2%葡萄糖和0.5%蛋白胨的培养基。待菌丝生长2~3周后, 从膜表面刮取蜜环菌菌落, 进行DNA提取。

1.2 DNA提取

DNA提取结合刘小勇等(1997)和Vanio等(1998)的方法进行。菌丝放在研钵中用液氮进行研磨, 转移到离心管后加含有2% SDS的裂解缓冲液(150mmol/L NaCl, 50 mmol/L EDTA, 10mmol/L Tris-HCl, pH7.4), 65℃保温30~40min, 离心去掉菌丝残体, 上清液加入1 10的10mmol/L NaCl溶液和1 10的10% CTAB缓冲液(10% CTAB, 500mmol/L Tris-HCl, 100mmol/L EDTA, pH8.0), 混匀后65℃保温15min。然后冰浴5min后, 加等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1), 用震荡器充分混匀20min, 14000r/min离心20min。用酚:氯仿:异戊醇抽提重复4次, 最后用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提。抽提后的上清液用0.6倍体积的聚乙二醇溶液(含20%(w/v) PEG 6000和2.5mol/L NaCl)沉淀, DNA在50℃下真空泵抽干后溶于含1mmol/L EDTA的6mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中备用。

1.3 PCR和RAMS扩增

采用位于rDNA大亚基3'端和5SrDNA5'端之间的基因间隔区(intergenic spacer region, IGS)和位于17SrDNA3'端和25SrDNA5'端之间的内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)进行PCR扩增。扩增IGS的引物LR12R和0-1按Anderson (1992)的序列, 扩增ITS的引物ITS1和ITS4按(White, 1990)的序列进行合成。引物浓度2μmol/L, 使用Dynazyme ⅡDNA聚合酶, 反应体积50μL。样品先在95℃下预变性10min, 加入酶后执行以下35个循环:95℃ 30s, 55℃ 55s, 72℃ 2min, 最后一个循环72℃延伸10min。

RAMS (Random Ampilified Microsatellite, 随机扩增微卫星)技术最初由Zietkiewicz等(1994)报道, Hantula等(1996)首次应用于菌物研究中, 该方法综合RAPD覆盖整个基因组、微卫星的多态性丰富以及定向PCR的重复稳定性强等优点, 同时又摒弃RAPD和定向PCR方法的缺点, 是目前研究遗传变异的较好方法。微卫星引物设计按照Hantula (1996;1997;1998), Stenlid (1993), 本文采用TCG、CGA、M13、GAAA4个微卫星引物的序列见表 2。RAMS扩增基本同上述PCR程序, 采用热启动PCR以防止低温过程中非特异性扩增。各引物的退火温度见表 2。

1.4 PCR产物的内切酶消化

将扩增的PCR产物的NaCl终浓度调节到0.3mol/L, 然后加2倍体积的无水乙醇, 置冰上1h, 14000r/min离心20min取沉淀, DNA50℃真空抽干, 加各内切酶缓冲液溶解后, 约20μ1PCR产物的溶液量加Alu Ⅰ、Hae Ⅲ、Hinf Ⅰ和Tag Ⅰ 10-15U, 37℃下酶切16-24h (TagⅠ在65℃下进行酶切反应)。

1.5 电泳检测和DNA数据处理

RAMS产物和酶切后的PCR产物使用Synergel (Diversitfied Biotech)和琼脂糖(Promega co.)各1%制胶, 电泳在TAE缓冲液(40mmol/L Tris-Acetate, pH8.0;1mmol/L EDTA)进行, 溴乙锭染色, 紫外光下观察照相, 用DNA100 bp ladder (Gibco BRL)判断分子片段大小, 一般误差在10bp左右。比照国外同类研究的做法, 进行不同研究结果的片段比较时, 误差在5bp左右视为谱带相同。rDNA-RFLP图谱和RAMS图谱进行0, 1转换后, 用PHYLIP软件包(3.57版)的混合简约算法(Mixed parsimony algorithm)程序构建Wagner简约无根系统树, 根据系统发育树探讨其亲缘关系。

2 结果与分析 2.1 RFLP结果(图版Ⅰ)

PCR扩增的IGS和ITS两个DNA片段的RFLP表明, IGS较ITS片段的多态性高, 能够检测到种下更多的变异, 而且它产生的多态性同菌株的地理起源相关, 而ITS的仅有较小的多态性, 也无法建立同菌株的相关性, 所以ITS仅进行了部分菌株的初步酶切, 整个实验的高卢蜜环菌的分子定型以IGS的RELP进行划分。根据四种内切酶的图谱, 将来自3个大陆的23个高卢蜜环菌菌株划分为以下6个IGS类型。Gal (A)仅含97027 29一个菌株, 该类型比较特殊, 它产生的四种IGS酶切图谱同其它各高卢蜜环菌菌株都不同, 而以AluI和Hinf Ⅰ为特征图谱, 目前欧洲和北美各国均未发现该类型, Terashima (1998)报道日本北海道的高卢蜜环菌产生的IGS-AluI图谱(317, 209, 135bp)可能与此型比较近似, 该类型是亚洲特有的类型。Gal (B)包括中国吉林省3个地点的10个菌株, 它们生的IGS-AluI和IGS-TagI图谱同其它菌株截然不同, 迄今其它国家均未发现该图谱类型, 是中国产高卢蜜环菌的主要图谱类型。Gal (C)包括美国、加拿大、德国、卢森堡、波兰和中国等欧亚美3个大陆6个国家的菌株, 显然是世界性广泛分布的图谱类型, Harrington (1995)最初发现该IGS-AluI (399, 240, 183bp)型仅存在于两个欧洲菌株, 称为高卢蜜环菌的欧洲型(A.gallica European RFLP group); White (1998)报道了加拿大存在两个IGS-AluI型, (400, 235, 190bp)和(400, 245, 190bp), 其中一个为变异类型; Sierra (1999)报道欧洲也存在该IGS-AluI型(400, 240, 190bp); 这些结果都证明该类型为全世界共有的图谱类型。在gal (C)中, 由于来自加拿大的NA2菌株在IGS-Hae Ⅲ图谱同其他菌株不同, 将其另列为C2亚型, 而相应地将其余的菌株划分为C1亚型。Gal (D)也仅含一个来自卢森堡的89111菌株, 但它产生的4种酶切图谱同其它各菌株不同, 该类型迄今也未曾报道; Sierra (1999)报道的欧洲高卢蜜环菌的另外两个IGS-AluI型(400, 250, 140, 190bp和390, 230, 190bp)也没有包括该类型。Gal (E)四个来自美国的菌株, 它们的IGS-AluI和IGS-Hae Ⅲ图谱同其它的截然不同, 是一个具有明显特征的图谱, 迄今尚未在其它国家发现, Harrington (1995)将其(582, 240bp)称为高卢蜜环菌的美洲型(A.gallica Ameracan RFLP group), 本实验也证明是美国特有的类型。RFLP实验结果见表 3。

2.2 基于RFLP的系统分析

基于RFLP数据建立的系统树如图 1所示,可以清楚地发现,3个大陆的菌株之间存在明显的地理性遗传分化,在图中划分为中国群体(CH)、欧洲群体(EU)、北美群体(NA)和亚洲群体(AS),同RFLP的直观图谱一致。CH包括的菌株同gal(B)完全一致,NA包括的菌株则全由gal(E)组成,而EU不仅包括2个北美的菌株(NA1和NA2),而且还有一个中国菌株96011 22,同gal(C)基本相似,只是多了gal(D)的一个菌株。亚洲群体AS(96027 29)游离于所有的3个群体之外,也就是gal(A),之所以称为亚洲群体,是因为该RFLP类型尽管本研究只发现一个中国菌株,但日本可能比较普遍(Tarashima, 1998)。通过系统树,使3个大陆的地理性变异比RFLP图谱更加直观明确。

2.3 RAMS实验结果与分析

RAMS实验结果如照片所示, 根据照片建立了各菌株的TCG、CGA、GAAA和M13的RAMS分子片段多态性数据表, 23个菌株共产生81项(0, 1)型多态性数据, 构成一个23 ×81的矩阵(因数据过大省略)。应用PHYLIP软件包有关程序建立了RAMS无根系统树(图 2)。根据这一结果, 有4个高卢蜜环菌的遗传发育系存在, 分别是欧洲(EU)和中国(CH)的两个纯系, 北美-欧洲(NA-EU)和北美-中国(NA-CH)的两个混合发育系。发育树表明, 北美的高卢蜜环菌同欧洲和中国的系统亲缘关系比较近, 而中国同欧洲的亲缘关系比较远。同时发现北美和中国的高卢蜜环菌群体都存在较大的遗传分化, 特别是北美菌系, 产自太平洋沿岸的菌株同中国菌系遗传相似, 而产自大西洋沿岸的菌株同欧洲菌系相似。在NA-FU和NA-CH两个发育系中, 不同大陆的菌株的遗传亲缘关系要远远大于同一大陆的菌株, 这种情况, 在蜜环菌分子系统学研究中还是首次发现, 表明北美的蜜环菌存在的两个发育系具有不同的起源, 它们分别同亚洲和欧洲大陆的高卢蜜环菌近缘。

根据RAMS结果构建的最小生成树的结果(图 3)同系统树分析结果基本一致, 主要显示出亚洲、北美-欧洲和欧-亚-美3个发育系, 同系统树的比较发现EU和NA-CH 2个发育系具有比较近的亲缘关系, 而中国菌株之间的遗传差异要远大于3个大陆之间。综合RAMA的系统树和最小生成树可以发现, EU、CH、NA-EU和NA-CH的4个发育系基本成立, 中国、欧洲和北美的3个高卢蜜环菌群体中都存在这样的现象:即不同大陆高卢蜜环菌菌系间的亲缘关系具有共同的发育起源, 而相同大陆的同种菌系则为多系起源。

3 讨论

尽管全球通过遗传交配鉴定的蜜环菌生物种已近30种(Korhonen, 1995;Shaw, 1991;贺伟, 1996;秦国夫, 2000;Ota, 1998), 但是尚未发现一种蜜环菌为全球性分布, 北半球分布的也只有高卢蜜环菌和奥氏蜜环菌两种。因此, 研究它们的地理遗传多样性, 特别是建立一个准确的系统发育关系就成为研究蜜环菌起源和进化的很好的途径, 同时也为快速进行分子鉴定蜜环菌提供一些基础数据。本研究的6个高卢蜜环菌的IGS-RFLP类型不仅为快速鉴定中国东北地区的高卢蜜环菌提供了准确的分子依据, 并通过这些IGS-RFLP型发现了高卢蜜环菌的3个大陆的遗传群体, 更主要的是通过一项覆盖整个基因组的RAMS技术检测到的81个多态性基因座位, 建立了高卢蜜环菌的系统树。RFLP和RAMS技术具有不同的应用范围, RFLP扩增的IGS不足1000bp, 用的只有4种内切酶, 所检测到的遗传变异信息非常有限, 因而只能用它来进行菌株的归类; 而RAMS揭示的是整个基因组的遗传变异情况, 承载的多态性信息比RFLP更丰富, 因此在进行亲缘关系分析时比RFLP的证据更充分一些。综合RFLP和RAMS结果, 可以发现北美西部和东部两个遗传群体的异源性是显而易见的, 中国的96027同中国其它群体的异源性也很强, 而同日本的比较近似。Coetzee (2000)发现了北美东部和西部两个A.mellea s.s.的异源性群体, 在ITS序列上, 西部的同亚洲的更接近, 而东部的同欧洲的更近缘(Coetzee et al., 2000)。本研究发现高卢蜜环菌也存在同样的现象。虽然仅仅根据本研究还难以作出全球性高卢蜜环菌起源和进化规律的推断, 但在这种规律的启发下, 随着其它证据的积累, 高卢蜜环菌的起源和进化途径将会被发现。

利用IGS-AluI的RFLP图谱类型快速鉴定蜜环菌各种被欧洲和北美许多研究证明是可行的, 但是由于中国的蜜环菌遗传多样性较欧洲和北美都高, 整个蜜环菌属产生的RFLP图谱类型也非常丰富, 因此, 仅应用一种内切酶还难以区分所有的生物种, 而采用几种内切酶的组合则有助于问题的解决(结果另文发表)。在研究中发现, RAMS方法是目前最简便有效的分子多态性检测技术, 其优点:(1)多态性高, 微卫星普遍存在于生物基因组中, 可选择性非常大, 适当的引物产生的多态性可同AFLP方法相当; (2)稳定性极强, 由于所用的引物是基因组中真实存在的序列, 因而可以使用很高的退火温度, 不像RAPD技术那样因引物序列的随机性只能采用很低的退火温度, 造成可重复性差, 实验误差较大; (3)实验过程简单, 同常规PCR一致, 较AFLP和RAPD方法可操作性都强; (4)使用的微卫星引物序列往往与单拷贝基因相连锁, 是非常有效的遗传标记。因此, 目前欧洲的许多菌物分子系统学工作, 特别是研究种和种下水平的分子遗传多样性的工作, 主要都采用此项技术进行。本研究也进一步证实RAMS是研究蜜环菌遗传进化关系的有效方法。