杨叶枯病(Alternaria alternata (Fr.) Keissler)是我国东北、西北、华北等地区杨树主要病害之一。该病菌既危害插条苗, 又危害实生苗, 发病最重者整株叶片会全部枯死(向玉英, 1986)。这种病害给林业生产造成了很大的经济损失, 已成为影响当地杨树优质高产的主要因素之一。因此, 培育抗杨叶枯病的杨树品种非常重要。

林木抗病性是林木育种的重要目标之一, 传统的抗病育种是一项十分艰苦耗时的工作。对于林木的抗性不象作物只需维持一个短短的生长季, 而是需要持久、能经历百年甚至上百年的考验。如能在分子水平上对抗病基因进行操作, 不但可提高选择的效果, 同时必将加速抗病的育种进程, 使林木达到高产优质。近年来, 利用分子标记技术与分群法BSA (Bulked Segregant Analysis) (Michelmore et al., 1996)相结合在林木抗病基因研究方面取得了一定进展。比利时Cervera (1996)以美洲黑杨(Populus deltoides Marsh.)为材料, 建立抗病池(resistant bulk)和感病池(susceptible bulk), 结合AFLP和BSA两种技术, 鉴别出3个与抗杨叶锈病(Melampsora larici-populina Kleb.)紧密连锁的分子标记, 为进一步克隆抗性基因奠定了基础(Cervera et al., 1996)。法国Benet (1995)等以榔榆(Ulmus parvifolia Jacq.)与榆树(U.pumila L.)及它们的杂种为实验材料, 研究抗榆树黑叶斑病[Stegophora ulmea (Schw.:fries) Sydow & Sydow (syn.Gnomonia ulmea) ]的基因。利用RAPD与BSA结合, 鉴别出3个与抗病基因连锁的分子标记(Benet et al., 1995)。Devey (1995)等以糖松(Pinus lambertiana Doug1.)大配子体为材料, 利用上述技术获得了6个与抗松疱锈病(Cronartium ribicola J.C.Fishcher ex Rab.)相连锁的标记(Devey et al., 1995)。我国虽然已经开展了林木抗病标记筛选探索性研究, 但目前尚无有关找到与林木抗病性相连锁的分子标记报道。

本研究的目的是利用分子标记RAPD与BSA结合, 寻找对我国杨树主要病害杨叶枯病抗性基因相连锁的分子标记, 为抗病品种的早期鉴定和分子标记辅助抗病育种提供依据, 为创造抗病基因工程品种提供条件。

1 材料和方法 1.1 植物材料

用于分池的F₂代群体来自美洲黑杨(P.deltoides Marsh.) ×青杨(P.cathayana Rehd.) F₁中两个个体近交组合生产的后代。F₂群体种植在中国林业研究院林业研究所试验苗圃。

1.2 叶枯病菌接种和病情分析

用于接种的杨叶枯病菌由北京林业大学森林资源与环境学院森保系提供。接种方式是孢子悬浮液喷雾接种。孢子悬浮液浓度为每视野250个孢子(10×10倍镜)。室内接种在中国林业科学研究院林业研究所温室进行, 1998年2月用1年生枝条切枝水培, 整枝喷雾, 接种过的枝条先用塑料袋套3 d, 观察记录发病时间。接种1个月后统一调查病情, 每株调查5片叶子。室外接种在中国林业科学研究院苗圃进行, 1998年5月对当年春季幼苗接种, 接种及调查方法均与室内接种相同。

病情分级标准:以病斑所占叶片比例分为:Ⅰ级0;Ⅱ级15%以下; Ⅲ级15%以上(苏晓华等, 1998)。

1.3 DNA的提取

参考苏晓华文献(苏晓华等, 1998)。

1.4 RAPD分析

10-mer随机引物(kits OP-A-OP-M, OP-N, OP-X)购自Operon公司。RAPD扩增反应的总体积为25 μL, 其中包括MgC123.5 mmol/L; 4种核苷酸各为0.2 mmol/L; 引物0.2 μmol/L; 模板DNA20 ng; Tag酶0.75单位(Smartlong公司)。反应程序如下: 95℃预变性5 min, 然后进入循环; 94℃变性1 min, 36℃复性1 min, 72℃延伸2 min, 共45个循环, 最后在72℃延伸10 min, 结束后保存在4℃条件下。RCR仪为Perkin Elmercetus DNA Thermal Cycler 480。扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳, 溴化乙锭染色, 紫外灯(MP⁺⁴)下观察, 拍照。

1.5 分离标记选择

用卡平方(χ²)检验F₂群体RAPD标记及抗病性是否符合3:1分离比例。

1.6 遗传作图

采用MAPMAKER version 3.0b软件对F₂分离群体的RAPD标记和抗性的分离数据进行连锁分析。利用两点测验, 推测可能的连锁群:计算所有成对座位的重组率和最大LOD值, 推测可能的连锁群, 要求LOD值≥2.0, r重组率≤0.4。然后, 对每个连锁群中的标记作多点分析。采用Kosambi函数, 将重组率转换成图距单位(Centimorgan, cM)。在F₂群体中, 感病植株和抗病植株分离比例为3:1, 推测抗性是由一对隐性基因控制的, 将抗病植株赋值为2, 感病植株赋值为5。

2 结果与讨论 2.1 抗病池和感病池的建立

以美洲黑杨与青杨杂交3代谱系为材料, 经在室内外进行杨叶枯病接种及病情分析研究, 已证明了美洲黑杨对杨叶枯病的抗性在其F₂群体分离比例符合1:2:1 (见表 1), 抗病株与感病株比例为1:3 (36R:94S;x₁²:3=0.58, 0.7 > P > 0.8), 说明美洲黑杨对杨叶枯病的抗性Ala是由1对纯合隐性等位基因控制(苏晓华等, 1998)。从抗病和感病的F₂群体中分别随机选取5个单株, 在每个单株内取等量的叶片混合提取DNA, 获得抗病(或感病)混合的DNA池。

2.2 抗病池和感病池的RAPD分析

本研究随机选用400个10-mer引物, 均可在抗感两池的模板DNA中扩增出DNA片段。每个引物扩增的片断数目不尽相同, 少的只有1条, 多的达到15条, 平均为7.5条, 约在220~4072 bp之间。大多数引物(占97.5%)在两池模板DNA中扩增的产物相同, 但有1个引物(占0.25%)即H-12在两池间扩增出2个多态性片段, 且经3次以上重复, 均获相同结果, 其中RPH12-4 (RPH-12₈₄₀)在抗病池中出现, 而在感病池中不出现; RPH12-6 (RPH-12₇₅₃)仅在感病池出现, 在抗病池中不出现, 如图 1所示。为了确认与抗感有关的特异带型, 又对抗(感) DNA池打开, 对每个个体进行检测, 结果引物H-12仍能扩增出与抗感池相同的结果(图 2)。

2.3 与抗(感)病性相连锁标记分析和图谱定位

为了进一步确定与抗(感)杨叶枯病基因Ala相连锁标记, 利用引物H-12对经抗性鉴定的美洲黑杨×青杨杂种F₂ 80个无性系进行了RAPD分析。结果表明, 这80个无性系对杨叶枯病抗性与RPH12-6和RPH12-4标记有共分离(图 3), 由此可以推断RPH12-6和RPH12-4均是在RAPD水平上与抗杨叶枯病基因Ala相连锁的分子标记。经卡平方(x²)检验表明, 这两个标记均符合3:1分离比率。这一结果与表型抗性检测结果是一致的, 因此从分子水平上进一步证实了美洲黑杨对杨叶枯病的抗性是由1对隐性纯合基因控制。我们在1998年已利用MAPMAKER软件建立了一个美洲黑杨×青杨杂种分子连锁图谱, 该群体由80个植株组成, 所建图谱含有110个标记, 标记位点间平均间距为17.27 cM (苏晓华等, 1998)。在此基础上, 进一步利用MAPMAKER软件对F₂分离群体的抗病RAPD标记和抗性的分离数据进行连锁分析, 将标记RPH12-6和RPH12-4定位在已构建的连锁框架图上。图 4显示了美洲黑杨(P.deltoides Marsh.)抗杨叶枯病基因在第3条连锁群上的位置, 该抗性基因称为Ala, 与RPH12-6和RPH12-4间的遗传距离均为3.60 cM (图 4)。

目前, 一些农作物已从抗性基因的定位(易小平等, 1998)、分离(张德水等, 1997)和克隆(董继新等, 1999; Satomi et al., 1998)走向抗性基因操作实用阶段。如Song等(1995)对分离出的水稻抗白叶枯病(Xanthommas oryzae pv.oryzae)基因Xa-21, 利用染色体登陆技术(chromosome landing)进行了克隆, 并获得了转基因植株(易小平等, 1998)。而在林木抗病基因定位研究中, 只进行到能找到与抗病相连锁的标记(Benet et al., 1995; Cervera et al., 1996; Devey et al., 1995; Newcombe et al., 1996; Wilcox et al., 1996)阶段, 还未见到有关林木抗病基因分离及克隆方面的报道。本研究获得的2个标记, 经过F₂分离群体验证后, 证明RPH12-6标记与抗杨叶枯病基因Ala紧密连锁, 我们将以这个分子标记为起点, 通过染色体行走进而分离这个抗性基因, 有利于揭示其抗病机理, 以便早日将生物技术服务于生产实践。