芫花(Daphne genkwa S.eb.et Zucc.)是瑞香科的一种多年生小灌木, 广布于我国长江流域。其中含有多种有毒成份, 如:瑞香素A、B、C、D, 3-羟基芫花毒素等。研究表明(莫建初, 1996; 王海等, 1998), 芫花的乙醇浸提物及其初步分离的活性组份对卫矛金星尺蠖(Abraxas miranda)、菜粉蝶幼虫具强烈的抑食和胃毒作用; 在非择食条件下使前者取食量比对照减少68% (王海等, 1998); 使后者在择食条件下减少取食量90% (王问学等, 1999)。为了探明芫花的杀虫机理, 为发现新的药物作用靶标和创制农药提供新线索, 我们研究了芫花粗提物对菜粉蝶幼虫消化酶系的影响。

1 试验材料

芫花  采自湖南株洲市龙头铺镇。剥下茎皮烘干, 粉碎后备用。14%芫花粗提物的制备:用50 mL无水酒精浸泡7 g芫花24 h后过滤定容至50 mL。

试虫  菜粉蝶(P. rapae)幼虫, 采自野外没有施药的苞菜(Brassica oleracea)上, 待涂14%芫花粗提物的苞菜叶表面凉干后喂虫。

2 研究内容及方法 2.1 芫花粗提物对试虫中肠消化酶系的影响

挑取在芫花乙醇粗提物上饲养1 d、龄期一致的4~5龄幼虫, 逐条用分析天平称其重量, 在冰浴中解剖, 取出中肠, 在4 mL缓冲液中把肠腔内食物洗出, 取出肠组织放在另一个4 mL缓冲液中, 用匀浆器把肠壁组织及食物分别匀浆, 再以4000 r/min离心5 min, 取其上清液作酶液。对照组为取食未处理叶的幼虫, 提取酶液方法同上。每处理10条。

淀粉酶用I₂-KI (陈长琨, 1996; 谢麟阁, 1982)法测定。转化酶用3, 5-二硝基水杨酸法测定(冯慧, 1989), 海藻糖酶3, 5-二硝基水杨酸法测定, 脂肪酶用α-醋酸萘酯和固蓝盐B法测定(冯慧, 1989)。蛋白酶用双缩脲法测定(沙槎云等, 1981)。

2.2 芫花粗提物对菜粉蝶幼虫中肠组织结构的影响

解剖在用芫花粗提物处理过的叶片取食1、2、3 d的菜粉蝶幼虫, 取出中肠, 按常规石蜡切片法制片观察。中肠在2.5%戊二醛中固定2 h以上, 送请湖南师范大学电镜室代做电镜切片。

3 试验结果 3.1 芫花乙醇粗提物对消化酶的影响

芫花乙醇粗提物处理试虫24 h以后, 各消化酶活力指数变化如表 1、2。从表 1、2可见, 处理试虫中肠除海藻糖酶酶活力指数下降且差异达显著水平外, 其它几种酶活力指数均有所升高, 但升高的程度不同:肠组织中淀粉酶、蛋白酶活力升高的程度达显著水平; 酯酶、转化酶活力升高的程度未达显著水平。同时表中显示, 处理后肠组织中淀粉酶、酯酶、转化酶活力升高的程度大于肠腔中(海藻糖酶、蛋白酶未测定), 这说明芫花先刺激肠组织大量分泌消化酶液, 引起消化酶活力指数的升高, 从而导致肠腔中酶活力指数的升高。至于酯酶活力在肠组织远大于在肠腔中, 则与其属细胞内消化酶有关。

3.2 芫花粗提物对中肠组织结构的影响

用芫花处理菜粉蝶幼虫24 h后, 细胞核向肠腔方向移动, 肠壁细胞中的空泡数量很多, 而且较大, 围食膜比较完整, 微绒毛完好。48 h后, 肠壁细胞变厚, 排列有些混乱, 空泡数量增多。细胞靠近肠腔一侧出现成片的空泡区, 围食膜部分消失, 食物与肠壁细胞接触。72 h后, 空泡数量极多, 但较小, 围食膜消失, 食物与肠壁细胞接触, 微绒毛表现出明显的病变, 能观察到的细胞核减少。

电镜观察表明正常情况下线粒体(m)为粒状, 内嵴清晰(图 1-1), 核(n)内物质分布均匀(图 1-4); 用芫花粗提物处理24 h后, 线粒体内嵴开始变得模糊(图 1-3), 特别是部分细胞内粗糙内质网(rER)上的核糖体增多(图 1-2), 这一变化与测得的处理试虫酶活力提高相吻合, 部分细胞核质开始向内收缩(图 1-5); 处理72 h后作为能量工厂的有些线粒体的内嵴已完全消失, 只剩下一个肿胀的空壳(图 1-6), 这从细胞水平上说明了由于芫花的抑食作用, 试虫的能源入不敷出, 只好动用体内贮能来维持生命, 从而导致体重负增长, 活动能力下降, 最后死亡。

4 结果与讨论

用涂有芫花粗提物的叶子喂菜粉蝶幼虫24 h后, 引起中肠淀粉酶、酯酶、转化酶、蛋白酶活力指数不同程度的升高, 而海藻糖酶活力指数下降。

虽然芫花粗提物在体内引起各种消化酶的活力指数增强, 但肠组织中酶活力增加的程度比肠腔中大得多, 这说明芫花粗提物是先影响肠组织, 引起分泌的酶量增加, 然后才使肠腔中酶活力增加。这与苦皮藤素V对东方粘虫中肠消化酶无显著影响的情况不同(刘惠霞等, 1998)。

与常规胃毒剂抑制消化酶系活力而导致中毒昆虫营养不良直至死亡的情况相反, 芫花粗提物使试虫消化酶活力增强, 其中尤以对肠壁细胞(非肠腔)的作用更大。电镜照片显示部分细胞粗糙内质网上核糖体增多也支持了酶活力增强的实验结果。既然毒素使消化酶系活力提高, 为何中毒昆虫却体重减轻、试虫较快死亡?我们认为原因有二:一是毒素进入肠腔后, 刺激肠壁细胞超量分泌消化酶来与毒物结合或降解它, 以缓解或消除其毒害作用, 这样就使虫体消耗了大量用于组成消化酶的氨基酸和能量, 导致体能衰竭(从电镜照片的线粒体崩解, 粗糙内质网结构模糊、混乱获得佐证); 二是由于胰蛋白酶等超量分泌使含硫氨基酸大量消耗, 造成了氨基酸各组份的比例失调, 导致营养贫乏(anti-nutritional effects) (Broadway, 1986)。

芫花粗提物进入体内是否引起其它解毒酶系(如多功能氧化酶)的变化, 则有待进一步研究。