近年来, 有关研究表明, 松材线虫感病木的木材化学成份与健康木相比, 其酸性物增加, 选择适当的指示剂, 通过指示剂在被检木上的颜色反应可以作为松材线虫病的快速检疫的一种方法(王玉嬿等, 1996)。但是, 在大量测试过程中也发现, 直接在被检木的木质部上染色会因木材本身颜色、含水量及外界环境因素(如空气相对湿度、酸碱度等)的影响和干扰造成显色不明显而较难确认。本试验采用被检木钻木屑的有机溶剂提取液进行颜色反应来区分松材线虫病、健木, 不仅排除了上述的各种干扰, 提高了检疫的准确率, 而且达到了快速检疫的要求。

1 试验材料 1.1 样木及来源

本试验样木选取5种松树: (1)黑松Pinus thunbergii采自江苏南京、安徽滁县; (2)马尾松P.massoniana采自江苏南京、安徽滁县、浙江舟山和广东惠阳; (3)赤松P.densiflora采自江苏南京; (4)火炬松P.teada采自江苏南京; (5)湿地松P.elliottii采自江苏南京。

1.2 指示剂的选择和配制

根据松材线虫病、健木pH值的变化范围选择、配制了7种指示剂进行筛选:指示剂1号, 0.1%乙醇溶液(90%乙醇作为溶剂); 指示剂2号, 0.1%乙醇溶液(20%乙醇作为溶剂); 指示剂3号, 0.1%水溶液; 指示剂4号, 0.1%乙醇溶液(20%乙醇作为溶剂); 指示剂5号, 0.1%乙醇溶液(70%乙醇作为溶剂); 指示剂6号, 0.1%乙醇溶液; 指示剂7号, 0.05%水溶液。将上述配制好的指示剂分别置于棕色窄口瓶内保存备用。

1.3 有机溶剂

70%~80%乙醇。

1.4 试验仪器和条件

该项研究本着既科学又便于推广应用的原则, 制定试验方案时首先考虑到排除使用较复杂仪器设备和实验室条件, 因此本试验不一定在实验室条件下进行, 仅需下述一些简单的仪器即可: (1)手摇钻或电钻; (2)水浴锅或保温瓶; (3)试管(约200 mm长, 直径20~25 mm) :10~20支; (4)指形管(约100 mm长, 直径10 mm) :40支; (5)试管架; (6)滴管:10支; (7)蒸馏水。

2 试验方法 2.1 取样

将所选各种松树病、健样木分别于上、中、下3个部位用手摇钻或电钻钻取木屑约5 g, 袋装标记备用。钻取木屑前应将取样部位的树皮刮干净。

2.2 样木乙醇提取液的制备

将钻取的木屑分别按标记装入各大试管中, 倒入70%~80%乙醇, 乙醇在试管中的高度约为木屑高度的1.5~2倍, 管口用脱脂棉紧密封塞。立即将试管置于水浴锅或保温瓶中的80 ℃~90 ℃的热水中, 并使管中液体小沸10 min。然后取出试管置于冰水中冷却后备用。

2.3 显色反应

取与试样对应数量的指形管, 对应标号。分别取上述冷却后各试管中的上清液约2~3 mL置入相应指形管中。然后用滴管分别滴入2滴事先选定的指示剂, 摇匀, 观察颜色变化, 记录结果。

3 试验结果 3.1 指示剂的筛选

对采自江苏林业科学研究所试验林中的5种松树病、健木, 利用已配制好的7种指示剂按上述试验方法进行室内初试, 结果表明:指1号和指4号在松材线虫病、健木提取液中所显示的颜色区别比较明显, 颜色区别见表 1。因此, 本试验选择这两种指示剂作为检测试剂。本文主要记述指1号的检验结果。

3.2 松材线虫病各疫区5种松树病、健木提取液颜色反应的检验结果

经初步筛选后, 用指示剂1号分别对江苏、安徽、浙江、广东4个疫区黑松、马尾松、赤松、火炬松、湿地松病、健木提取液进行了检验, 检验结果见表 2。

3.3 不同取样部位的木样提取液颜色反应结果 3.3.1 同一植株上、中、下3个部位任意取样

本试验基本取样方法均为此法, 从试验结果来看, 无论病木还是健木, 每一植株上、中、下3个部位的颜色反应基本一致。

3.3.2 距地面不同高度和靠近羽化孔取样

对浙江富阳亚林所的3株马尾松松材线虫病伐倒木和2株健康木分别作了如下取样:

病1号:距地面2 m处取样3个, 其中1样靠近羽化孔; 病2号:距地面1、2、3 m处各取样1个, 其中距地面1 m处的1样靠近羽化孔; 病3号:距地面1、3、4 m处各取1个, 其中距地面1 m处的1样靠近羽化孔。以上颜色反应均为淡黄色。

健1号(带树皮原木) :任取1样; 健2号(方料) :任取1样。以上颜色反应均为淡青绿色。

3.3.3 边材与心材的混合样

马尾松病、健木pH值测定时被粉碎的试样为边、心材的混合样, 将此样进行颜色反应检验, 共取病木9株, 健木7株, 其结果病木均为草绿色, 健木均为兰色。

4 结果分析与讨论 4.1 病、健木显色差异

从表 1见:利用指示剂1号和4号对黑松等5种松树乙醇提取液的颜色反应进行快速检疫, 均可明显地区分出松材线虫病、健木。其中黑松、马尾松、赤松的颜色反应一致, 对指示剂1号健木均呈淡青绿~淡兰, 病木均呈淡草绿~淡黄; 对指示剂4号健木均呈淡绿~绿, 病木均呈黄绿~淡黄。而火炬松、湿地松病、健木提取液所呈现的颜色恰相反, 这主要由于树种的不同导致其pH值不同。本文对上述5种松树病、健木的pH值作了比较, 就其平均值(见表 3), 黑松、马尾松、赤松病木pH值均明显低于健康木, 而火炬松病木平均pH值明显高于健木, 因此火炬松与黑松等显色刚好相反。湿地松病、健木平均pH值明显高于前几种松树, 同时病木和健木之间差异较小, 因此也可能出现显色相反。

4.2 指示剂1号的检疫准确率

用指示剂1号对江苏和安徽两疫区的黑松病、健木各33株99个样检验结果, 平均准确率可达96%;对江苏、安徽、浙江、广东疫区马尾松病木50株132个样、健木48株130个样检验结果, 平均准确率为89%;对江苏疫区的赤松病、健木各7株21个样检验结果, 准确率达100%;对江苏疫区的火炬松病、健木各6株18个样检验结果, 准确率为92%;对江苏疫区的湿地松病、健木各6株18个样检验结果, 准确率为59%。从上述结果可见, 除湿地松外, 指示剂1号对黑松、赤松、马尾松、火炬松的颜色反应进行松材线虫病的检疫, 其准确率均已达到检疫检验对准确程度的要求。湿地松病、健木颜色反应准确率很低, 这与湿地松平均pH值明显高于其它种松树, 且病、健木平均pH值差异很小相吻合。黑松和赤松都是对松材线虫敏感的树种, 而马尾松虽属抗性树种, 但在我国自然界也表现出感病, 只是其感病程度仍然比黑松和赤松低, 而湿地松为抗病树种(杨宝君等, 1987)。由此看来, 对松材线虫越敏感的树种, 其酸性物质增加越明显, 即其pH值降低的越显著, 其检疫检验准确率就越高。其中火炬松的情况有些例外, 火炬松亦属抗性树种, 但在本研究中其病、健木颜色反应准确率较高, 对病、健木的pH值进行分析有差异, 可是病木的pH值不但不下降反而升高, 其原因较为复杂, 有待进一步探讨。

4.3 准确率的地区差异

从试验结果看不同地区来源的试样准确率相差不大, 如江苏和安徽的黑松准确率分别为95%和96%, 4个疫区的马尾松准确率略有差异, 安徽和广东两疫区略低些, 为85%和82%, 这与马尾松本身就比黑松、赤松准确率低有关。

4.4 取样部位对准确率的影响

考虑到松材线虫不同发育时期在树体内分布的变化, 即取样部位是否会影响检验结果的问题, 所以也对不同取样部位的试样颜色反应情况进行了测试。从测试结果来看, 取样部位对本检验方法的准确率基本没有什么影响, 这主要是由于感染松材线虫的病死树其酸性物质增加是指整个树体(上、中、下, 心材和边材)而言(尤纪雪等, 1994), 并不是某一部分, 因此本方法取样部位与检验松材线虫的情况不同, 并不影响其准确性。

4.5 钻木屑有机溶剂提取液显色的优越性

利用钻木屑的有机溶剂提取液进行显色比直接在木段截面上或木屑上显色更清晰、准确, 这主要是由于排除了木材本身的颜色、含水量, 以及外界环境因素的影响。制备钻木屑提取液的过程相当简单, 加入有机溶剂后浴热约10 min即可, 且可多个样同时进行。

5 结论

综上所述, 采用指示剂1号在被检木的钻木屑有机溶剂提取液中的颜色反应进行松材线虫病的快速检疫, 其准确率不受被检木的地区来源、含水量及取样部位的影响, 仅与寄主树种对松材线虫的抗病性大小有关, 对松材线虫越敏感的树种, 检疫的准确率就越高。其显色十分直观、同时所用工具及设备简单、经济, 可操作性强, 因此这种检疫方法可在松材线虫病检疫中广泛推广应用。