松树枯梢病[Sphaeropsis sapinea (Fr.:Fr.) Dyko & Sutton]是世界范围内针叶树上的重要病害之一(Gibson, 1979;Palmer et al., 1985;Rees et al., 1988;Swart et al., 1985)。该病在我国分布地域广, 受害寄主多, 发生危害严重(吴小芹, 1999)。根据对该病菌营养体亲和性等方面的研究, 发现其种群存在一定的分化现象(吴小芹, 2000)。从遗传学观点来看, 遗传多样性也就意味着基因多样性, 它决定了物种进化的潜势。一个物种的遗传变异越丰富, 对环境变化的适应性也就越大。掌握病原真菌遗传变异的细微结构是进行群体遗传学和流行学研究的一个重要方面。因此, 为了从根本上弄清S.sapinea的种内变异情况, 了解该菌对寄主与环境变化适应的潜能, 本研究运用RAPD技术对从我国13个省(区)收集的该菌菌株进行种一级水平基因多态性的检测, 以期从分子水平上揭示该病菌的遗传变异本质及其亲缘关系, 为进一步弄明该菌的流行特点和实施综合治理提供参考依据。

1 材料和方法 1.1 供试菌株来源

供试55个菌株来源于我国13个省区, 寄主包括16种松树和其它2种针叶树, 详见表 1。

1.2 菌体制备

将保存于PDA斜面的各供试菌株分别移植于Φ90 mm的PDA平板, 在25 ℃无光照恒温箱内生长4 d。用Φ5 mm的灭菌接种环切取边缘生长旺盛的带菌培养基块, 接种至铺有灭菌隔离膜的PDA平板上, 于上述同一条件下生长4 d, 尔后获取菌丝体并将其迅速放入-30 ℃低温冰箱中冷冻保存备用。

1.3 菌体基因组DNA的提取

取新鲜冷冻的菌丝体(约400~600 mg)加液氮将其迅速研成粉末。随即将粉状样品倒入盛有600 μL CTAB裂解缓冲液[ (1 %CTAB, 5 %PVP, 10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0), 20 mmol EDTA (pH8.0), 1.4 mol/L NaCl, 75 mmol/L疏基乙醇]的1.5 mL Eppendorf管中, 并将该管置入65 ℃水浴中加热30~40 min。取出后将其放入-20 ℃冷冻室内迅速冷却约15 min, 使样品充分裂解。随后加入等体积氯仿:异戊醇(24:1, v/v), 倒转此管充分摇匀使之成为乳状液。用Beckman GS-15R台式冷冻离心机在20 ℃下将样品离心10 min (1000 r/min), 取其上清液转管, 去沉淀。重复上述氯仿:异戊醇抽提、离心2次。将含样品DNA的水相移入新管, 加入2/3至等体积预冷的异丙醇, 轻缓倒转该管并置-20 ℃冰箱冷冻室中40~60 min以沉淀DNA。取出该离心管在低温下(4 ℃)高速离心15 min (13000 r/min), 倒去水相。将所得沉淀用预冷的400 μL 70 %乙醇及400 μL无水乙醇各洗1次, 气干40 min。用200 μL重蒸水重新溶解沉淀, 再加入2.5倍体积的无水乙醇冷冻40 min后再低温(4 ℃)高速离心10 min (1300 r/min)。弃水相后加入预冷的70 %乙醇和无水乙醇再各洗沉淀1次。将沉淀气干2 h。最后将此DNA沉淀溶于100 μL TE缓冲液[10 mmol Tris-HCl (pH 8.0), 1 mmol EDTA]中于-20 ℃下保存。为使各样品DNA浓度趋于一致, 取2 μL各DNA模板样品, 用溴化乙锭染色, 在1.2 %琼脂糖凝胶上电泳。根据电泳结果, 以在紫外光下见到痕迹量的DNA为准用TE分别稀释其它较浓的样品, 再统一检测所有DNA模板样品并稀释调节至均一浓度。

1.4 PCR扩增体系和反应条件

DNA扩增反应在美国Perkin-Elmer公司生产的PE-9600型PCR基因扩增仪上进行。PCR反应采用20 μL扩增体系, 其组成如下:5 ng左右模板DNA, 10 pmol引物, dATP, dCTP, dGTP和dTTP各为200 μmol/L (上海生工生物工程有限公司), 2 μL 10 x扩增反应缓冲液[100 μmol Tris-HCl (pH8.3), 500 mmol/L KCl, 20 mmol/L MgCl₂, 0.01 %明胶, 5.0 g/L BSA], 1.5 U Taq DNA聚合酶(上海生工生物工程有限公司), 5 μL Taq酶稀释液[10 mmol Tris-HCl (pH8.3), 25 mmol BSA], 无菌超纯水补至20 μL。上面覆盖20 μL石蜡油, 以防高温反应时反应液的蒸发。扩增反应条件为:第1步, 预变性, 94 ℃, 2 min; 第2步, 94 ℃变性, 30 sec; 40 ℃退火, 30 sec; 70 ℃延伸, 1.5 min; 循环38次; 第3步, 最后1次延伸, 72 ℃, 7 min。反应中同时设立不加模板DNA的对照。反应结束后, 以1×TBE (Tris-Boric acid, EDTA)为电极缓冲液, 将扩增产物在含有溴化乙锭(1 μg/mL)的1.2 %琼脂糖凝胶上[胶的一侧同时点上标准DNA (100 bp DNA Ladder, 上海生工生物工程有限公司) ]于5 v/cm电场强度下电泳3 h。将电泳检测结果在透过式紫外灯下观察并用快速成像系统(FoTo/Spectrum^Tm)拍照。

1.5 引物筛选

随机选取美国Operon公司生产的OPA、OPB、OPC、OPD、OPE、OPK和OPX组中96个寡核苷酸引物, 先用1个DNA模板样品进行PCR反应, 根据扩增结果, 即条带的有无, 从上述引物初筛出有扩增产物的引物; 再用12个DNA模板样品进行PCR反应, 根据扩增条带的数量、特异性和可重复性对有产物的引物进行复筛。最后, 选出具稳定多态性引物用于全部55个DNA模板样品的PCR扩增。

1.6 数据分析

把电泳图谱中每个位点上扩增条带的有无分别记为1和0。RAPD标记名称用引物名+扩增片段的碱基长度(分子量大小)来表示。遗传变异的水平度量用总多态位点百分率统计:P=L/n。式中, L=RPAD测定的多态位点数, n=RAPD测定的所有位点总数。任意2个个体间的遗传差异采用Nei-Li (1978)方法计算遗传相似度(S)和遗传距离(D)。

遗传相似度     Sxy=2 Nxy/ (Nx+Ny)

遗传距离     Dxy=1-2Nxy/ (Nx+Ny)

式中, Nxy为x和y两菌株共有的RAPD标记数, Nx和Ny分别为x和y菌株拥有的RAPD标记数。

全部数据通过Francis C.yeh等编制的用于群体遗传分析的POPEGNE软件包(POPGENE Veision 1.21)进行运算和统计分析。并运用Felsentein编制的PHYLIP (3.5版本)的NEIGHBOR程序, 根据Nei (1978)的遗传距离应用算术平均数的非加权成组配对法(UPGMA:Unweighted Pair-Group Method Using an Arithmetic Average)构建树状图。

2 结果与分析 2.1 引物筛选

用菌体YN4作为模板DNA从96个随机引物中初筛出有扩增DNA片段的66个引物(约有31%的引物无扩增产物)。由于供试样本来源的地理区域较广, 为了减少55个菌株试验时出现缺带、不清晰或无效(单态)的扩增, 从66个引物中再选取48个引物, 用12种模板DNA (菌株A1, D2, F2, F9, GD1, H1, J4, J21, JX4, LZ2, S6和YN4)再进行复筛。结果在选用的48个引物中筛选出17个能有效扩增出RAPD图带(具稳定多态且带型清晰)的引物(见表 2)。

2.2 菌株间的遗传多态性

用筛选出的17个随机引物对55个DNA样品进行PCR扩增后共得到200个RAPD标记(其DNA片段分子量在0.27~3.20 kb之间), 其中多态性标记197个, 占98.5 % (表 2)。这表明, 在S.sapinea菌株间存在较丰富的DNA序列多态性(图 1)。

在17个供试引物中, 各引物检测到的且判别清晰的RAPD位点数介于6~21之间, 平均每个引物提供12个RAPD标记的信息量(表 2)。在一定的扩增条件下, 扩增的条带数在理论上取决于基因组的复杂性。S.sapinea的扩增条带数较多, 也从一个方面反映了该菌的基因组可能较大。

2.3 菌株间的遗传变异分析

遗传相似度(Genetic similarity)或遗传距离(Genetic distance)是衡量群体RAPD变异水平的重要指标。采用前述的计算方法, 根据S.sapinea各菌株两两之间共有的及特有的RAPD标记数, 得出不同菌株间的遗传相似度(Sxy)和遗传距离。结果显示, 55个菌株间的遗传相似度变化较大, 其相似性最小值为0.46, 最大值为1.00, 其中绝大多数菌株间(约80%以上)的相似值变动范围在0.86~0.97之间。菌株A1 (安徽火炬松)、D1 (黑龙江樟子松)、F6和F7 (福建火炬松)之间的遗传相似性最大(Sxy=1);菌株D2 (黑龙江长白赤松)与它们的遗传相似性极为接近(Sxy=0.995);这5个菌株与其它大多数菌株的遗传相似值在0.86~0.91之间。菌株F2 (福建湿地松)、J2 (江苏海岸松)和J4 (江苏黑松)相互间的遗传相似性也较大(Sxy值分别为0.930和0.925);然而, 它们与其余52个菌株的遗传相似值却较小(Sxy为0.505~0.600)。菌株GD2 (广东马尾松)和LZ1 (广东加勒比松)与其它53个菌株的遗传相似性最小(前者Sxy为0.490~0.545, 后者Sxy为0.465~0.540), 它们二者间的相似性也不大(Sxy=0.640)。从总体水平上看, S.sapinea中国群体内的遗传变异较为丰富。

2.4 菌株间的亲缘关系分析

根据系统聚类结果, 若确定遗传相似度的一定值(0.60 < Sxy < 0.64)作为划分类群的标准, 则可将55个菌株分为3个类群: (1)、菌株GD2和LZ1, 它们与其它菌株的亲缘关系最远; (2)、菌株F2、J2和J4, 它们与其它菌株的亲缘关系较远; 3)、除(1)、(2)外的所有菌株, 彼此间亲缘关系较近(Sxy < 0.860)。在此3类群中, 第2类群与第3类群的亲缘关系略近于第1类群与第2类群之间。在包括了50个菌株的第3类群中又可分为两大组:①、A1、D1、D2、F6、F7和YN1、YN4、YN5、YN6 (前者与后者又分为2小组)。它们间的亲缘关系很近, 而两小组内的亲缘关系则更近。前一小组内的菌株地理上相距很远(纬度跨越从N26.2°→N32.4°→N45.7°), 后一小组内的菌株则处在同一地理区域(N24.5°)。②其余41个菌株。在此大组中, 菌株间仍存在着一定程度的差异, 其内部还可分为若干小组, 但毕竟它们间的亲缘关系要近于它们与其它组或类群之间(见图 2)。

2.5 特征基因位点与性状表达的联系

在本试验17个引物的扩增图谱中, 有些引物的某个扩增片段仅为某些菌株所特有, 这些片段成为分析菌株间相互联系的重要依据。如OPD-18的1300 bp仅YN4和YN6所共有, OPD-20的1350 bp仅J13和S6所共有, OPA-03的2700 bp和OPC-14的1350 bp仅为A1、D1、D2、F6和F7所共有, 而这3组菌株正好分别同属3个VCGs, 即其组内菌株营养体呈亲和反应(吴小芹, 2000)。OPD-20的2500 bp仅为F9、GD1和GD2所共有, 尽管GD2在大多数位点上与F9和GD1差别较大, 但在供试的55个菌株中只有这3个菌株分离自马尾松流脂的树干。另外, 还有OPA-02的500 bp、OPC-08的1130 bp和OPX-02的1800 bp均为A1、D1、D2、F6、F7、YN1、YN4、YN5和YN6所共有, 这些菌株在PDA上生长时所分泌的色素均比其它菌株早而多。可见, 上述特征位点可能与控制菌株的VCG表达、浸染部位和发病症状以及色素分泌等特性有关。

2.6 菌株间差异与寄主和地理来源的关系

供试的S.sapinea 55个菌株的聚类分析表明菌株之间的差异与寄主种类似乎没有明显关系。这种缺少寄主特异性的特点为解释该病菌具有如此广泛的针叶树寄主范围提供了分子遗传上的论据。但各菌株之间的差异或类群划分与地理来源或生境变化似有一定关系。如第1类群的GD2和LZ1仅发生在广东地区, 第2类群的F2、J2和J4均来自东南沿海地区(福建长乐、江苏连云港和东海)。然而, 在地理来源涉及全国13个省区(包括广东和东南沿海地区)的第3类群的50个菌株间, 却又没有明显表明与地理来源有必然的联系。尽管此类群下的个别小组划分与地理来源仍有相关, 但大多数菌株缺少区域相关性的特点。这可能与S.sapinea群体间基因交流较频繁有关。

3 讨论

在现代分子生物学研究中, 应用PCR扩增DNA已成为一种非常有用的实验手段。而在此实验中, DNA的质量是影响扩增效果的重要因素之一。已报道的从林木病原真菌中提取DNA的材料主要有2种, 一是从繁殖体孢子中提取DNA, 这主要用于一些无法用人工培养的专性寄主菌(Hamelin, 1996)。专性寄主菌由于只能在寄主活体上生存, 其菌丝体生于树体内部而不易收集, 故只有实地获取其成熟外露孢子器中的孢子体。但此易受到不同个体气传孢子的交叉污染且提取量受限。二是从营养体菌丝中提取DNA, 这主要用于一些兼性寄生菌(秦国夫等, 1996;Hansson et al., 1996;Hoegger et al., 1996;Huang et al., 1995;Smith, 1995;Stanosz et al., 1995)。菌丝体能在实验室规模培养多少满足了提取大量DNA的需求。但以往所需的菌丝体多由液体培养所获得, 其菌丝团含液态培养基, 掺合了其它生物材料, 须经过滤、冲洗、压干水分或离心等步骤, 花时费力且因菌丝体仍含一定水分加液氮后易形成冰块而难以研磨。本试验采用改进的固体(PDA)培养法培养S.sapinea各菌株, 结果在短期内获得了不含培养基成分、不需任何处理即可用于提取DNA的菌体材料。同时真菌细胞壁因含几丁质而破壁不易, 所获得的供试菌体含水量少也使加液氮后极易研成粉状而充分破壁。因此, 改良固体培养法对其后提取高得率、高纯度的DNA提供了材料保证。另外, S.sapinea的培养时间以4 d (25 ℃)为宜, 因为超过4 d该病菌就会分泌墨绿色素易使DNA和其它物质铰在一起而不易纯化。

目前, 用于PCR扩增的林木病原真菌DNA的提取, 主要采用: (1) SDS法(Sodium dodecy1 sulfate), 如Gremmeniella abietina (Hansson et al., 1996)、榆枯萎病菌(Ophiostoma ulmi) (Hoegger et al., 1996)、蜜环菌(Armillaria mellea) (秦国夫等, 1996)和松枯梢病菌(S.sapinea) (Smith et al., 1995;Stanosz et al., 1996)等; (2) CTAB法(Cetyl-trimethyl-ammonium-bromide), 如茶藨生柱锈菌(Cronartium ribicola) (Hamelin, 1996)和松针褐斑病菌(Mycosphaerella dearnessii) (Hunang et al., 1995)等。本研究在预备试验中曾选取S.sapinea的16个菌株采用上述两种方法进行DNA的提取。电泳检测表明, 经SDS法提取的DNA杂质较多[泳道上红带(RNA)明显], DNA量不稳定; CTAB法提取的DNA杂质较少, DNA量较均匀。用OPA-03、OPA-20、OPK-04、OPX-02和OPX-08等5个引物分别扩增由SDS法和CTAB法提取的8个菌株的DNA, 结果由CTAB法提取的DNA其扩增后的产物条带数多于SDS法提取的DNA。因此, 与SDS法相比, CTAB法较适于S.sapinea菌体DNA的提取。

S.sapinea供试菌株的分子聚类结果证实各菌株间差异与其针叶树寄主种类无明显相关, 与其地理来源在某些类群间有一定联系, 但在大多数菌株间相关趋势不明显。这些特点, 可能就使得S.sapinea种下大多数菌株在侵染和传播过程中既无寄主上的限制又无地理上的隔离, 而易于发生和流行, 增加了防治的难度。另外, 本研究在黑松和湿地松上分别发现两种差异较大属不同类型的菌株, 从林间调查来看, 其中一类型菌株所在的林分林地条件差、发病程度重。因此, 环境条件对S.sapinea种下菌株发生变异究竟有何影响、程度如何有待深入研究。

Smith等(1995)和Stanosz等(1996)曾对美国中北部和中西部针叶树上根据培养性状等分出的松枯梢病菌A型和B型菌株进行了RAPD分析, 结果证实它们分归2类, 其型间菌株的遗传相似性明显低于型内菌株间。本研究中国菌株的RAPD分析结果与其培养性状所作的类群划分(吴小芹, 2000)基本上是一致的。至于中国菌株在类型上与美国菌株的关系, 尚有待对中美菌株在同一试验条件下(特别是RAPD分析)加以比较后才能作出准确的判断。

采用RPAD技术快速有效地检测出了S.sapinea基因组DNA的变化, 并避免了培养观察和接种分析中一些无法克服的缺陷, 如培养条件、接种环境和调查方法等而产生的差异。因此, RAPD技术为快速监测S.sapinea的种群遗传变异提供了方便有效的手段, 并对分析各性状的基因控制、彼此间的亲缘关系以及病害发生与流行等都具有重要的实践指导意义。