银杏(Ginkgo biloba L.)原产于我国, 是多用途的经济树种, 具有较高的经济价值, 尤其是银杏叶中含有黄酮、内酯等多种生理活性物质, 对心血管疾病有独特疗效, 因此, 银杏叶提取物及其制剂在国际市场上供不应求, 中国的银杏叶也成为韩国、德国、法国等国家商人的竞争对象。近几年来, 全国各地银杏产业发展迅速, 各地陆续建立了银杏采叶园, 但在采叶园营建技术, 栽后的栽培管理措施方面的研究尚未跟上。本文在叶用园建园材料的选择方面作了较系统的研究, 以期为银杏采叶园的营建及管理提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验设在江苏泰兴市七里林场。1994年春, 从浙江、河南、山东、江苏等银杏产地叶产量较高的优良单株(当地已经过选择)采集枝条, 分别嫁接在1年生的砧木上, 参试的优良单株(以下简称优株)计13个。优株代号分别为E₁、E₂、E₃、E₄、E₅、E₆、E₇、E₈、E₁₀、W₂、W₃、W₄、W₅。嫁接砧木的规格基本一致, 采用劈接, 每1砧木嫁接1根接穗, 每根接穗保留2个芽。每1优株占1苗床, 株行距为40 cm×40 cm。每1苗床150株, 立地条件及栽培管理措施基本一致。

1.2 研究方法 1.2.1 根杏单株叶产量的测定

在全面调查的基础上, 从每一优株的嫁接苗中选取10株标准株, 叶片全部采下、称量、取平均值。

1.2.2 黄酮含量的测定

银杏叶中黄酮含量季节变化及根茎叶中黄酮含量采用比色法(沙世炎等, 1981; 陈秀珍, 1988)测定。10月份黄酮含量采用高效液相色谱法(Screen, 1992; 苑可武等, 1997)测定。仪器HPLC色谱仪为Waters公司, 510泵, Lambda-Max 481检测器, 740数据处理机, 色谱柱为Waters Nova-Pak C₁₈柱(4.6 mm×20 cm); 样品处理:取干燥样品1 g于索化提取器用甲醇提取, 提取液浓缩至干, 以30 mL甲醇溶解残渣, 加5 mL 25 %盐酸, 80 ℃水溶回流1 h, 水解液用甲醇定溶至50 mL; 测定:流动相为甲醇(A), 0.4 %磷酸(B)。梯度为38%A, 流速为1 mL/min, 波长为368 nm, 进样量10 uL、柱温35 ℃; 计算:总黄酮= , 式中A为峰面积, C为浓度, a、b、c为槲皮素, 山奈酚, 异鼠李素峰面积。

1.2.3 内酯含量测定

内酯含量测定采用高效液相色谱法(Van, 1991)。仪器:高效液相色谱仪为Waters公司, 510泵, Lambda-Max 481检测器, 740数据处理机, 色谱柱为Water Nova-Pak C₁₈柱(4.6 mm×20 cm)。样品处理方法:取干燥粉碎干叶500 mg, 用5 mL 10 %甲醇水溶提取15 min, 过滤, 将滤液过聚酰胺柱(1滴/s), 蒸发, 残渣用甲醇溶解, 加入少量苯甲醇和水。色谱条件:流动相为水-甲醇-二氢呋喃(7:2:1), 流速为1 mL/min, 检测波长219 nm, C₁₈柱, 计算方法:含量，G为峰面积, I.S为内标(苯甲醇)峰面积, M为银杏样重, R为参数。

1.2.4 叶面积用Model 11-3000型叶面积仪测定。 2 结果与分析 2.1 叶面积和叶产量 2.1.1 单叶面积和单株叶面积

不同来源的银杏其单叶面积和单株叶面积存在差异, 表 1列出了13个优株的单叶面积和单株叶面积。从表 1可以看出, 各优株的单叶面积和单株叶面积存在显著差异。优株E₃、W₄单叶面积最大, 为21.43 cm², 优株W₂单叶面积最小, 仅为8.99 cm²; 而单株叶面积最大的优株是E₂, 达到5814 cm², 超过13个优株平均值的100.44%;其次为E₄、E₆, 两者分别超过平均值的69.3%和38.4%;单株叶面积最小的优株为W₃、E₈, 其值分别低于平均值的51.53%、49.4%。

2.1.2 叶产量

叶产量是银杏叶用园建园材料筛选的最重要的指标之一。从表 1可以看出, 在10月份, 叶产量最高的优株是E₄, 干重为158.11 g, 最低的优株是W₃, 干重只有16.94 g, 其中E₁、E₂、E₄、E₅、E₆各优株的干重分别超过13个优株平均值的56.1 %、82.0 %、135.7 %、58.4 %、54.9 %, 而E₈、E₁₀、W₃、W₅则分别低于平均值的66.5 %、65.3 %、74.7 %、65.5 %。各优株叶产量高低的顺序是:E₄ > E₂ > E₅ > E₁ > E₆ > E₃ > E₇ > W₄ > W₂ > W₁₀ > W₅ > W₈ > W₃。

从表 1可以看出, 6月份单株叶产量只占10月份最终产量的较小的一部分(有些优株如W₃、W₄、W₅等例外), 这主要是由于6月份以后, 叶面积虽然不再增大, 但光合产物在叶片中越积越多, 叶片含水量下降, 以及7月上中旬, 新叶叶腋内芽萌发展叶的结果。

2.2 总黄酮含量及其组成成份 2.2.1 叶片中的黄酮含量及组成成份

黄酮类化合物是次生代谢产物, 不同植物其体内黄酮类化合物的合成、分解及累积的程度存在差异(J.B哈本, 1983), 因此, 不同银杏植物叶中黄酮含量必然存在差异。

从表 2可知, 总黄酮含量最高的优株为E₇, 其次为E₄、W₂等, 它们分别超过平均值的25.4 %、15.1 %、10.6 %; 含量最低的优株是W₃, W₄、W₅次之, 它们分别低于13个优株平均值的37.3 %、30.4 %、19.0 %。13个优株总黄酮含量高低的顺序为:E₇ > E₄ > W₂ > E₆ > E₅ > E₁=E₁₀ > E₂ > E₃ > E₈ > W₅ > W₄ > W₃。

2.2.2 不同银杏优株总黄酮的组成成份

银杏总黄酮主要由槲皮素、山奈酚、异鼠李素的糖甙组成, 从表 2和表 3可以看出, 槲皮素在银杏叶总黄酮中所占的比例最大, 约占50.8 %~61.8 %; 山奈酚次之, 约占19.1 %~31.1 %; 异鼠李素最小, 约占11.9 %~22.8 %。其中, 优株E₂, 槲皮素的比例最大, 达到61.8 %, 山奈酚所占比例最大的优株为W₄, 达到31.1 %, 异鼠李素所占比例最大的优株则是E₁, 其值为22.8 %。

2.2.3 根、茎、叶中的黄酮含量

黄酮类化合物广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果实和种子中, 不同器官的生理、生化特性不同, 且黄酮类化合物在植物体中又有位置效应, 因此, 不同器官代谢所产生的黄酮类化合物必然出现差异(周荣汉, 1985)。

表 4表明, 根杏植株各器官中黄酮类化合物的分布规律为:叶中含量最高, 其次是侧根, 再次为主根, 而茎中含量最低。

2.2.4 黄酮类化合物的季节变化规律

本文测定了13个银杏优株不同月份(5月、6月、7月、9月、10月)叶中的总黄酮含量, 以便了解银杏叶中总黄酮含量的季节变化规律, 这对于在生产实践中确定银杏采收期非常重要。银杏叶中总黄酮含量的季节变化曲线见图 1、2。

从银杏叶总黄酮含量季节变化曲线上可以看出, 银杏叶中总黄酮含量的季节变化趋势为:随着时间的推移, 黄酮含量有逐渐升高的趋势, 1年中, 黄酮含量最低的时间出现在6月, 9~10月含量达到高峰。

2.3 内酯含量及组成成份 2.3.1 各优株内酯含量

内酯作为银杏叶片中最重要的有效成分之一, 在供试的13个优株中, 存在显著差异(表 2)。内酯含量最高的优株为E₁, 其次为E₄、W₅、W₄, 含量分别为0.20 %、0.17 %、0.15 %、0.14 %, 分别超过13个优株平均值的48.1 %、25.9 %、11.1 %和3.7 %。含量较低的优株是W₃、E₈、E₁₀, 其值分别仅为0.09 %、0.10 %、0.11 %, 分别低于平均值的33.3%?、25.9 %、18.5 %。13个优株内酯含量高低顺序为:E₁ > E₂=E₄ > W₅ > W₄ > E₆=E₅=W₂ > E₇=E₃ > E₁₀ > E₈ > W₃。

2.3.2 内酯的组成成份

银杏内酯主要由4种成份组成:银杏内酯A、B、C (GA、GB、GC)和白果内酯(BB)。表 2和表 5表明, GA、GB、GC、BB等所占内酯的比例存在差别, 其中以GA所占的比例最大, 其变动范围约为35 %~55 %; BB次之, 但在优株E₅、E₆、W₃、W₄中所占比例少于GB、GC。BB一般所占的比例约为23 %~30 %; GB、GC的比例相差不大, 其所占的比例约为10 %~23 %。GA、GB、GC、BB所占内酯比例最大的优株分别是E₈和W₄、W₃、W₅, 比例分别为50 %、22.2 %、23.1 %、35.3 %。

2.3.3 银杏叶中内酯含量季节变化规律

银杏叶中内酯含量的季节变化曲线见图 3。图 3表明, 银杏叶中内酯及GA、GB、GC、BB等物质的含量随生长季节的变化呈现一定的变化趋势:内酯含量5月份最低, 然后逐渐升高, 8月底达到高峰, 此后逐渐下降, 特别是在10月, 下降幅度很大; BB的变化趋势与总内酯变化趋势相一致, GC变化很小, GB则有“高-低-高-低”模式。总的来看, 在一年中, 内酯的变化表现出“从低到高、从高到低”的变化规律。

2.4 优株的综合评价

从表 6可以看出, 黄酮产量最高的优株是E₄, 其次为E₅、E₂, 分别超过13个单株平均值的136.2 %、104.3 %、60.8 %。各优株黄酮产量高低的顺序为:E₄、E₅、E₂、E₆、E₇、E₃、E₁₀、W₂、W₄、E₈、W₅、W₃; 内酯产量最高的优株是E₄, 其次为E₁、E₂分别超过平均值的161.2 %、102.9 %、101.9 %。各优株内酯产量的高低顺序为:E₄、E₁、E₂、E₅、E₆、E₃、E₇、W₄、W₂、W₅、E₈、E₁₀、W₃; 内酯与黄酮总量即有效经济产量最高的优株是E₄, 其次为E₅、E₂、分别超过平均值的139.5%、96.4%、66.2%。名优株有效经济产量高低顺序为:E₄、E₅、E₂、E₁、E₆、E₇、E₃、E₁₀、W₂、W₄、E₈、W₅、W₃。

将各优株的有效经济产量作为各优株的代表值, 采用最短距离法, 对13优株进行系统聚类分析, 得到结果如下:

第1类:E₄

第2类:E₁、E₂、E₅、E₆

第3类:E₃、E₇、E₈、E₁₀、W₂、W₄、W₅

分析结果表明, 优株E₄在这13个优株中是最适于用来建立采叶园的优良优株, 而E₁、E₂、E₅、E₆其有效经济产量居中, 但都超过平均水平, 在生产实践中, 也可作为推广的优株。

3 结论与讨论

本世纪30年代开始, 国内外许多学者开展了银杏叶药用成份, 以及银杏叶黄酮及内酯的提取制备工艺、定性、定量测定、结构分析及临床药理效应等方面的研究工作, 并已取得了很大进展, 为银杏叶的开发利用奠定了基础(Teris, 1992; Lobstein, 1991)。本试验对13个优株的叶产量, 黄酮、内酯含量及其组成成份, 季节变化进行了比较系统的研究, 证明这些指标各优株间存在着显著差异, 因此, 根据以上几个指标对优株筛选是有效的(陈学森等, 1997)。作为叶用银杏优株, 选择应根据两个方面:一是叶产量大, 二是黄酮及内酯含量高, 这样才能获得较高的有效经济产量。在本试验条件下, 根据以上两个原则, 筛选出了E₄优良叶用优株, 并根据黄酮、内酯含量的年变化规律, 确定适宜的采收期应在9月至10月之间。

黄酮在各器官中分布规律表明, 黄酮类化合物的含量与各器官的代谢水平密切相关。在植物体内, 代谢最旺盛的器官叶和侧根, 含有较多的黄酮类化合物。各器官所含的物质只可能有两种来源:一是各器官自身合成; 另一则是由其它器官合成, 进一步转运到这个器官中。Milthrope和Moorby的嫁接实验表明, 黄酮类化合物越过嫁接部位向其它地方运输是不可能的(周荣汉, 1985)。因此, 银杏嫁接苗各器官中黄酮类化合物应是自身合成的, 并非由某一器官产生并转运到其它器官中去。内酯的年变化主要是受BB和GB的变化影响, 且与银杏的生长状况有一定的联系。5月初, 叶子展开不久, 光合能力弱、光合产物少。随着叶片的生长, 叶绿素的大量形成, 光合强度逐渐增加, 光合产物迅速增加, 合成内酯的前体物质甲瓦龙酸和乙酰辅酶大量生长, 此时内酯合成速度大于其分解速度, 因此, 内酯含量逐渐升高。至9月以后, 内酯合成速度逐渐减慢, 分解速度逐渐增强, 因此, 内酯的含量逐渐下降。以上13优株的试验调查只在一个地点进行, 且仅为苗期的实验结果, 若在其它地区推广应用, 是否存在地域效应尚不明了。另外, 随着苗龄的增加, 早晚期间的相关程度如何也有待于进一步研究。