杉木是我国南方特有的速生用材林树种, 随着大气环境日益恶化, 土壤酸化已成为人工杉木林地力衰退更新困难的重要原因。土壤酸化的一个严重后果是土壤中铝离子含量增大, 对植物产生毒害作用。近年来, 人们对铝的毒害和耐性的基础及应用方面已作了大量研究(张福锁, 1993; 刘东华等, 1995), 对酸性土壤铝毒问题在农业、林业和经济上的重要性已有一定认识, 但对植物铝毒和耐性的生理生化机制仍缺乏清晰的认识, 特别是针对林木的研究很少见报道。本文用³²P作示踪原子, 通过水培试验, 探讨酸性条件下铝对杉木幼苗根和叶吸收利用可溶性磷影响的研究结果, 揭示杉木在酸性土壤中受铝毒害的情况及其生理生化机制, 探索杉木纯林更新困难的地力衰退的根本原因, 为解决这一实际问题提供理论依据。

1 材料和方法 1.1 材料

供试1年生杉木苗, 取自雅安林场。水培营养液每升母液中含Ca (NO₃)₂·4H₂O 100 g, KH₂PO₄25g, MgSO₄·7H₂O 25 g, KCl 12.5 g, CaSO₄·2H₂O 100 g, 用时稀释100倍, 每升稀释液中加含有Fe (2.8mg/L)、Mn (0.5 mg/L)、Zn (0.05 mg/L)、Cu (0.02 mg/L)等微量元素的溶液1 mL。同位素NaH₂³²PO₄, 由中国科学院原子能研究所生产。

1.2 方法

水培试验在容积为1.4 L的长方形玻璃缸中盛稀释后的营养液300 mL, 每缸插栽4株杉木苗。试验设计pH=3和pH=5两个大组, 每组设对照和1个30×10^-4% (w/v)铝处理(向缸中加入AlCl₃溶液, 使营养液中铝达到所需浓度)。待插栽的杉木苗转青开始长新根时, 每缸一次性引入NaH₂³²PO₄70μci, 每天调pH, 7 d后终止水培。

取样  用自来水反复冲洗根部至洗出水不含放射性, 然后分别取根和顶尖叶片剪碎, 研磨成匀浆。

样品提取  样品中³²P-无机磷、有机磷化合物、脂类化合物、DNA、RNA的提取参照四川农业大学原子能应用研究室《核农学实验指导》进行: ①称取匀浆1 g左右于离心管中, 每个样设2个重复, 加入5%三氯醋酸5 mL, 摇匀后以3000 r/min离心10 min。②将上清液转入小烧杯中, 加入5 mL丙酮, 摇匀后加入2.5 mL钼酸铵试剂(5g钼酸铵溶于100 mL10%H₂SO₄中), 混合放置数分钟后转入分液漏斗中, 加10 mL水饱和的异丁醇与苯的混合液(取苯和异丁醇各15 mL并加入15 mL蒸馏水摇匀后静置分相, 上相为水饱和的异丁醇与苯相), 强烈摇动, 静止数分钟后溶液分为两相, 上层含酸性³²P-有机磷化合物, 下层含³²P-无机磷化合物, 收集两部分溶液于25 mL容量瓶中, 并分别用丙酮和蒸馏水定容。③将步骤②中的沉淀物先后用95%乙醇、乙醇:乙醚混合液(2:1, v/v)、乙醚各3 mL提取, 离心, 上清液合并于25 mL容量瓶中, 用丙酮定容, 内含³²P-脂类化合物。④沉淀物以0.5 mol/L KOH水解18 h (36℃~38℃), 冷却后以HClO₄液酸化至pH=1, 离心, 上清液为³²P-RNA。沉淀用5%HClO₄在90℃水浴中提取15 min, 离心, 上清液为³²P-DNA, 分别将两份提取液用蒸馏水定容到25 mL。

样品的测定用移液管分别吸取上述各提取液10 mL于闪烁瓶中, 用FJ-353闪烁仪, 进行契仑科夫计数测定³²P的强度, 读数单位为脉冲数·分^-1, 换算成每分脉冲数·g^-1 (cpm.g^-1)。

2 结果与分析 2.1 酸铝对杉木吸收和运输无机磷的影响

酸铝处理后, 杉木根对无机磷的吸收和向叶的转运都受到影响, 随pH降低, 影响愈加明显。由表 1可见, 在pH=5时, 铝处理后根³²P-无机磷为对照的112%, 而在pH=3条件下, 则增加到195%;与之相反, 在pH=5时铝处理后, 叶中³²P-无机磷降低到对照的91%, pH=3时同样处理后, 下降到对照的68%。另外一个事实是, 经铝处理后, ³²P向叶片运输指数都比对照降低, 特别在pH=3时, 下降幅度最大, 由43.0下降到20.7。以上结果表明, 在低pH条件下, 铝的存在使杉木根中无机磷的含量大大提高, 但这并不表明根吸收的无机磷也增加。因为在酸性条件下, Al³⁺成为土壤中溶出铝的主要形态(徐仁扣等, 1998), Al³⁺极易与磷酸结合形成磷酸铝沉淀而被吸附在根表面或质外体中, 正是这种吸附——沉淀反应, 减少了磷有效地被根吸收, 从而也减少了磷向地面部分的转运。

2.2 酸铝对杉木根和叶有机磷和脂类磷化合物含量的影响

表 2表明, 在pH=5时, 铝处理对杉木根和叶中的有机磷和脂肪磷化合物的含量影响不大, 但是在pH=3条件下进行铝处理后, 进入根和叶的有机磷和脂肪磷化合物的³²P显著减少, 根中分别减少到对照的62%和43%, 叶中分别减少到对照的65%和68%。进入这两种化合物的³²P减少的原因。一方面是酸性条件下铝与磷酸生成铝磷酸盐, 减少了有效磷吸收, 更重要的是由于Al³⁺与ATP形成Al³⁺-ATP络合物, 该络合物比Mg²⁺-ATP络合物更为稳定。这种Al³⁺取代Mg²⁺-ATP络合物中Mg²⁺的作用意味着Al³⁺可能影响一些以ATP为磷酸基团供体的酶促反应, 阻止磷酸基团进入糖类、脂类化合物。例如Womeck (1979)的研究表明, 在糖酵解途径中由于已糖激酶催化已糖磷酸化时需要Mg²⁺-ATP作为磷酸基团的供体, Al³⁺-ATP具有与Mg²⁺-ATP相似的结构, 因此成为已糖激酶的竞争性抑制剂而抑制已糖激酶活性, 使已糖磷酸化速度降低。

2.3 酸铝对杉木根和叶中³²P进入DNA和RNA影响

在本试验的各处理情况下, 杉木根和叶中³²P-DNA和³²P-RNA的变化呈³²P-有机磷和脂类化合物相似的趋势, 即在pH=5时, 铝处理后³²P-DNA和³²P-RNA和对照相比变化不大, 但在pH=3时, 铝处理后, 根中分别减少到对照的40%和52%, 叶中分别减少到对照的53%和75%。³²P进入DNA和RNA的多少, 反映出核甘酸前体掺入DNA、RNA量的多少, 间接地反映出DNA和RNA在试验期间合成速度的大小。很多试验都证明, 进入细胞的铝在核和线粒体中积累最多, 核中的铝主要结合在DNA的磷酸基(Matsumoto, 1988)部位。pH愈低, Al³⁺浓度愈高, 这种结合愈容易。铝与DNA结合, 往往会提高DNA结构的稳定性, 使双螺旋难于解开, DNA的模板功能受到影响, 进而影响到DNA的复制和转录。因此, 可以认为Al³⁺的存在可能干扰DNA、RNA的合成。在本试验中, DNA复制比RNA转录受到的影响更大一些, 原因有待进一步研究。

2.4 酸铝处理对杉木根和叶吸收磷总量和各种磷化合物比例的影响

分别计算各处理时根和叶吸收³²P总量(表 4)和各³²P化合物的比例(表 5), 我们更能清楚地看到酸性条件下的铝不仅影响到杉木磷的吸收, 影响到磷的代谢。pH=5时, 铝处理后杉木根和叶³²P总量和各种³²P-化合物比例变化不大。pH=3时, 根所含³²P总量变化也不大, 仅是对照的111%, 但各³²P化合物的比例却发生了很大变化:³²P-无机磷增加到对照的175%, ³²P-有机磷化合物、脂类、DNA和RNA下降最显著, 仅为对照的36 %。酸铝处理后叶中³²P总量下降为对照的66 %, 这主要是由于叶片的运输指数下降所致, 但各类³²P化合物的比例除DNA下降较大(为对照的82 %), 其余变化不大。因此可以认为酸铝对杉木根磷代谢影响较之对叶的影响更直接。这和我们在试验中观察到的现象是一致的, 在进行同位素示踪水培试验的7 d内, 酸铝处理的杉木新根生长缓慢, 长出来的也易变黄甚至烂掉, 而叶的变化不明显, 如果在同样情况下继续水培, 半个月后叶才出现缺磷现象。此外, 从酸铝处理后各³²P化合物变化比例来看, DNA合成速度受酸铝影响比其它化合物都大, DNA代谢受阻, 将会给杉木的整个代谢带来更大的负面影响。

3 讨论

(1) 各种形态铝中Al³⁺毒性最大, pH对铝毒性的大小有很大的影响。随着pH降低, Al³⁺所占比例逐渐增加, 当pH < 4时, Al³⁺成主要形态(徐仁扣等, 1998)。在pH=5条件下, 铝对杉木磷的吸收和代谢影响尚不明显, 但在pH=3条件下, 铝处理使杉木根对磷的有效吸收、转运及代谢都受到严重影响。因而, 控制土壤酸化进程, 可大大减少铝的毒害, 也是遏止人工杉木林地力衰退的重要措施之一。

(2) 在酸性条件下, 可溶性磷酸盐与Al³⁺作用生成不溶性铝磷酸盐而沉淀吸附在杉木根表或根内, 实际降低了根对有效磷的吸收, 阻止磷向地上部的转运和进入代谢过程, 引起杉木表现出缺磷症状。

(3) 在酸性条件下, 铝进入杉木细胞后易与有机磷基团相结合, 减少有机磷化合物、脂类磷化合物以及DNA、RNA的合成, DNA合成受阻表现特别突出, 造成细胞内基本代谢紊乱。在铝毒害的初期, 这种影响在杉木根内表现得比叶内更为明显。