与核基因组DNA相比, 叶绿体基因组DNA具有分子量小、多拷贝和结构简单等特点, 这些都有利于对叶绿体基因组进行分析(包括物理图谱的构件及特定基因的分离、鉴定和序列测定等)。一般来说, 动植物的大多数核基因, 包括曾经一度被认为是单拷贝的基因, 其实都是一些小的重复基因家族, 基因的重叠和缺失及假基因的形成, 都和这些重复基因家族有关。所有这些过程都会干扰与生物进化历史密切相关的DNA进化史。而在叶绿体基因家族中, 仅有两个作为一个遗传单位的反向重复区, 因此叶绿体微卫星(choloroplast microsatellite)具有自己独立的未被干扰的进化历史, 这一特点无疑对查明植物的进化历史具有无比的优越性。

叶绿体微卫星是近年来发展起来的一种新的分子标记技术。由于叶绿体基因不参加基因重组, 而是直接来自父本的花粉, 所以对于研究针叶树种有着特殊的意义。

在目前使用的绝大多数多态性分子标记系统中, 微卫星是变异率最高的(Dallas, 1992; Weber et al., 1993;Di Rienzo et al., 1994;Ellegren, 1995)。美加红松(Pinus resinosa Ait.)在等位酶分析中没有显示多态性(Fower et al., 1977;Allendorf et al., 1982;Simon et al., 1986;Mosseler et al., 1991)。RAPD通常在针叶树中具有很高的多态性, 但是在美加红松中只表现出有限的遗传多样性(Mosseler et al., 1992;De Verno et al., 1997), 通过微卫星发现了群体间的遗传多样性(Echt et al., 1998)。美加红松的叶绿体基因多样性明显高于多数纯合的核基因。而且通过叶绿体微卫星的研究认识到群体间阶梯状单模式(haplotype) ¹⁾的变异分布, 有助于对物种进化历史的理解并据此制定出群体保存策略。

1) 关于haplotype的含义:通过PCR对叶绿体DN A扩增后得到的产物, 在95度下3min使双链打开(变性), 迅速放入冰屑盒中使双链暂时不能结合(退火), 然后将这种打开了双链的叶绿体D NA片段(微卫星)中分别加入标准大小的标记(50, 100, 150, 和/或200bp), 加在6%的变性7M聚丙烯胶(Pharmacia)上, 在ALF automatic sequencer(Pharmacia)仪器上以35W功率跑80 min, 最后使用Fragment Manager software version 1.2(Pharmacia)软件来分析产物片断的大小。由于haplotype未见到国内权威的中文译名, 所以本文暂译为阶梯状单模式(参见图 2和图 3)。

在杉木(Cunninghamia lanceolata)的遗传变异研究中, 曾有学者做过部分群体的同工酶和RAPD方面的研究。秃杉(Taiwania flousiana)在分子标记方面的研究尚为空白。本文的研究目的是应用叶绿体微卫星这一新的分子标记技术来研究杉木和秃杉的遗传变异规律。

1 材料与方法 1.1 DNA提取

分别从5个杉木种源和7个秃杉的天然群体中取DNA, 每个群体分析了12~36粒种子。采用了两种DNA提取方法:a) QUIAGEN DNAeasy Plant kit; b) the protocol developed by Doyle JJ and Doyle JL (1990)。结果证明两种方法获得相似数量和质量的DNA。由于后者较为经济而被采纳为主要方法。

1.2 DNA的浓度测定

用Hoefer DyNA Quant 2000测定DNA浓度。从胚中提取的DNA浓度在0.5~3.0μg。

1.3 DNA扩增

所有的DNA都使用叶绿体微卫星DNA进行扩增。所有微卫星区域都用单链核苷酸(A/T)来表示。试验了各种不同的扩增条件(包括温度、循环次数和药品等)。通过试验获得的最佳扩增反应步骤(杉木与秃杉相同):5 min 95℃变性; 5 min 80℃加入Taq酶; 25次循环, 每次循环包括:1 min 94℃变性, 1 min 50℃退火, 1 min 72℃适温延伸。最后在72℃下延伸8 min, 使用了16种引物(Vendramin et al., 1996)对两个树种的DNA进行扩增, 反应使用了如下药品(最终总体积为25μL):

4种dNTP (每种0.2μM); 2.5 mM MgCl₂; 0.2μM引物对; 10X缓冲液(Pharmacia); 25ng模板DNA; 1U of Taq聚合酶(Pharmacia)。所有的反应混和液的准备都是由Biomek Workstation 2000机器人自动完成, 在Thermal cyclers Perkin Elmer mod.9600 PCR仪上完成扩增。

1.4 扩增产物的鉴定

扩增产物的鉴定是通过1%的琼脂糖电泳, 用溴化乙锭染色, 紫外光灯下显影、成像和打印照片。叶绿体微卫星的PCR产物分子量通常在80~200 bp之间(图 1), 在标准分子量的标记(V)中通常介于第2和第3集团之间。只有4种引物未出现扩增产物。在其余的12种引物中, 选择了扩增产物质量最好的6种, 它们的产物通过电泳得到鉴定(明显的单一带)。6种引物(Pt1075, Pt1100, Pt1250, Pt1520, Pt6375, Pt9400, 其代码含义见Vendramin et al., 1996)用来研究5个杉木种源和7个秃杉群体。

1.5 扩增产物大小的鉴定

在6种微卫星中分别加入标准大小的标记(50, 100, 150, and 196 bp), 加在6%的变性7M聚丙烯胶Pharmacia)上, 在ALF automatic sequencer (Pharmacia)仪器上以35W功率跑80 min。每个胶可加样2~3次。使用Fragment Manager software version 1.2 (Pharmacia)软件来分析产物片断的大小(图 1~3)。

1.6 统计分析方法

有统计分析中, 每种单型模式(haplotypes)都被看成是一个等位基因。有效单型模式数量:

无偏单型模式多样性

遗传距离:

群体内单型模式多样性s_w, 群体间遗传分化度R_st按照Slatkin (1995)的公式。

分子变异等级分析(AMOVA, Excoffier et al., 1992)使用D_sh²来衡量单型模式对间的距离。用Φ_CT、Φ_SC和Φ_ST来表示种间、种源间和种源内的遗传

群体内个体间的成对单型变异:

其中a_ik和a_jk是第i个个体和第j个个体在第k个型位点上的等位基因大小。

统计分析使用 Arlequin V1.1 和 PHYLIP V3.5软件进行。

2 结果与分析 2.1 各种引物的扩增效果及Taq酶浓度对扩增效果的影响

在6种引物中, 扩增效果以Pt1075和Pt9400最好, Pt1100和Pt6375中等, 而Pt1250和Pt1520较弱(见图 4和图 5)。对Pt1250和Pt1520使用2U的Taq酶可以显著地提高扩增效果(见表 1)。

2.2 假象的排除

在6个微卫星中Pt9400因在多次试验中未检测到分子量大小而被排除, 初步认定其在电泳中显示的亮带是由于引物片断引起的。其余的5个微卫星至少在种内群体间显示出了变异性。

2.3 分子变异的层次分析(AMOVA)结果

在Arlequin 1.1中设定杉木和秃杉为2个树种, 并构造树种—种源—种源内的层次结构进行AMOVA分析, 结果列于表 2。

在AMOVA分析中, 方差变量的44.64%来源于种间, 51.67%来源于树种内, 只有3.68%来源于种源内。可见, 杉木和秃杉在种一级上的遗传变异用微卫星分析是很容易区分出来的, 同时, 在树种内种源间存在着最大的变异来源, 而种源内部的遗传分化则相对很小。

2.4 种间聚类分析

用Arlequin 1.1计算群体间的遗传距离(离差平方和法), 用PHYLIP3.5的NEIGHBOR程序作UPGMA聚类分析, 用DRAWTREE作无根型系统聚类树(unrooted phylogenies)获得杉木与秃杉群体的聚类分析图(图 6)。在图 6中, 杉木(下半部的屏边Pinbian、黎平Liping、商城Shangcheng、江华Jianghua和全南Quannan)和秃杉(GA5、YN3、GA1、DJ、DA5、QQ5和QQ7)的群体明显地被区分开来。其中, 杉木中的黎平种源在聚类树上有独特的位置, 与其优良种源的位置相合(全国杉木种源试验协作组而云南屏边种源与秃杉种源多采自云南最接近而其余个种源江西全南湖南江华和河南商城聚在另一边。在秃杉群体中, 丹江林分(DJ)因其为混合群体而单独为一枝, 而其余的群体均为一个家系, 其中剑河种源(QQ5、QQ7、DA5和DJ)聚在右边, 而雷山和其它2个云南种源(GA1、GA5和YN3)聚在左边。

3 讨论与结论

(1) 关于可用的引物种类, 本研究试验了16种, 其中6种有扩增反应, 在这6种中Pt9400在一般琼脂糖电泳中显示了较强的扩增效果, 但在进一步的产物分子量大小测定中却未能检测到, 初步认定是由于引物的大小也正好和叶绿体微卫星大小相同, 在琼脂糖电泳中被误认为是扩增产物, 而在聚丙烯胶的在ALF automatic sequencer上却未能显现。这种情况在杉木和秃杉的群体中都同时存在, 但在本研究中每个群体一般只做了12粒种子, 应加大重复以作进一步的证实。另外, 在这16种引物中, 除了6种有明显扩增现象外, Pt3655在2U浓度的Taq酶条件下, 在部分群体也有部分扩增效果, 可作进一步研究。(2)叶绿体微卫星比同工酶和RAPD的变异性更大。但这并不表明它们的进化速度就更快, 而是因为它们来自于父本, 比核基因保存了更多的进化信息。杉木和秃杉都是进化历史悠久的树种, 将分子生物学的研究结果与常规田间试验研究的结果结合起来分析, 将有助于我们对树种的进化历史有更全面的了解, 有利于制定合理的基因资源保存策略和育种策略。全国杉木种源试验研究对杉木种源的遗传变异已有较多的研究, 如黎平种源在全国的种源试验中属于优良种源(全国杉木种源试验协作组, 1994), 它在微卫星的聚类树中处于较独特的位置, 而云南屏边种源在聚类树上与秃杉种源距离很近(秃杉种源多采自云南省和贵州省, 杉木和秃杉同属杉科, 自然地理分布基本相同), 但是秃杉这一珍贵的孓遗濒危树种的种源试验才刚刚开始, 利用叶绿体微卫星的特性研究其遗传变异中心(bottleneck)对于群体保存和利用有着重要的意义。本研究作为初步探索性研究, 获得了满意的结果。但是本次研究只分析了5个杉木群种源和7个秃杉群体, 最小的群体分析的样本数量为12个, 获得的信息尚不足以对树种群体变异中心提出可靠的结论。建议下一步的研究应加大研究群体数量和每个群体的样本数量并将实验室分析与田间试验结果结合起来获得更加完善的研究结果。