大量研究表明, 干旱对植物重要伤害原因之一是植物体类活性氧(包括O₂、H₂O₂、OH)的产生和消除失衡, 活性氧的增加对蛋白质、核酸、糖类、脂类等大分子物质造成伤害(Vehiba, 1986; Dong, 1992)。过剩的活性氧进攻生物膜类脂中不饱和脂肪酸促发膜脂过氧化, 引起生物膜脂分子结构的破坏。丙二醛(MDA)是膜脂氧化降解的主要产物, 也是目前最常用的膜脂过氧化指标(曹锡清, 1986)。干旱促使植物组织细胞膜脂的饱和脂肪酸成分含量上升, 不饱和脂肪酸指数下降。膜脂成分变化原因有多种, 其中一重要原因是膜脂过氧化许长成干旱胁迫导致逆境乙烯产生但是否与活性氧直接相关, 以及活性氧参与乙烯产生的机制目前尚不清楚。关于干旱胁迫致使植物细胞伤害机理方面的研究, 前人也已做了大量工作, 但大部分是以农作物为研究对象, 对抗旱性极强的重要造林针叶树种的干旱伤害机理的探讨未见系统报道, 同时植物在干旱伤害致死状态下生理生化水平上的变化缺乏研究。樟子松是我国北方重要造林树种, 具有极强的抗旱性, 研究其胁迫下膜脂变化特性, 有助于揭示其强耐旱性与膜保护功能的联系, 具有重要的理论和实践意义。本文以2年生樟子松(Pinus sylvesris var.mongolica Litv.)苗木为研究对象, 采用盆栽方法进行土壤干旱胁迫, 胁迫强度使苗木致死, 研究其膜脂过氧化及膜脂成分变化, 以及乙烯的产生, 为干旱胁迫下氧自由基的伤害机理阐明树木耐旱机理提供理论依据。

1 材料及方法

将两年生樟子松苗木4月份进行盆栽, 每盆5株。待根系生长恢复正常后, 6月份选择生长状况一致的苗木盆进行土壤干旱胁迫处理, 形成干旱不同时间的5个处理梯度苗木, 进行各项测定后全部复水, 1个月后观察苗木存活状况。

1.1 土壤含水量及叶片含水量的测定

烘干称重法(温度100℃, 12h)。

1.2 苗木水势的测定

应用压力室法测定, 测定方法参照李吉跃(1989)。

1.3 SOD酶活性测定

针叶液氮速冻粉碎后-30℃冰箱保存待用。0.5 g叶加入2.5 mL 0.05 M磷酸缓冲液(pH7.0)冰浴研磨, 匀浆15000 r/min下4℃离心20 min, 上清液即为SOD粗酶制剂。按武宝轩(1985)的方法测定SOD对硝基氮蓝四唑光还原的抑制。3 mL反应体系中含5×10^-2M磷酸缓冲液(pH7.8), 1.3×10^-3M蛋氨酸, 7.5×10^-6M对硝基氮蓝四唑, 100 nM EDTA, 2×10^-6M核黄素, 4000 lux荧光灯照光15 min, 560 nm处测定光吸收。一个单位SOD酶活性定义为能引起反应初速度半抑制时的酶用量。

1.4 MDA含量的测定

按林植芳(1984)的方法。将1.5 mL SOD粗酶液加入5 mL含0.5%硫代巴比妥酸的20%三氯乙酸溶液, 混匀100℃水浴30 min, 冰上冷却, 1800 r/min离心15 min, 上清分别于532 nm和600 nm处测定光吸收。ΔEMm (532-600nM) =155计算MDA的毫克分子浓度。

1.5 膜脂肪酸成分的测定

参照苏维埃(1980)方法进行膜脂肪酸的提取和纯化。取1 g叶片, 用2:1氯仿-甲醇溶液研磨提取, 再用石油醚反复冲洗中性脂, 得到极性脂。四甲基氢氧化铵和碘甲烷进行甲脂化, 正己烷萃取。日立-163气相色谱仪测定, 氢焰检测器, 5 m×0.02 m玻璃填充柱(Chromosorb W, AW, DMCS, 80-100目为担体, 30%聚乙二醇丁二酸脂为固定液), 190℃柱温。以标准脂肪酸的保留时间定性。面积归一化法计算脂肪酸摩尔百分数。

1.6 乙烯释放量的测定

取完整针叶1 g, 放入具刻度的大针管中, 密封。4 h后抽取管中气体测定乙烯浓度, 采用日立-163型气相色谱仪测定乙烯浓度。色谱柱为200 mm×2 mm (I.D.) GDX-502, 柱温50℃。载气为氮气。氢焰离子化检测器检测, 检测温度100℃。

2 结果与分析 2.1 干旱胁迫下樟子松针叶SOD活性MDA含量的变化

图 1指出, 干旱胁迫15天, 苗木水势由-0.2 MPa下降至-0.5 MPa, 表明植物受到轻度水分胁迫, SOD活性从631.4 U/gdw迅速上升至833.3 U/gdw, 随着干旱时间延长, 胁迫进一步加强, 苗木水势下降至活性仍维持在一个高水平表明细胞膜酶促保护系统保护能力增强, 但此时MDA含量明显上升, MDA作为膜脂过氧化指标其含量上升表明膜系统受到伤害, 这说明酶促保护系统中仅SOD酶活性上升不能独立完成保护作用。干旱胁迫39天, 苗木水势下降到-3.8 MPa, 植物受到严重水分胁迫, SOD酶活性水平明显下降, 此时MDA含量迅速上升为对照的2.13倍, MDA含量的上升可能是SOD水平下降引起。

2.2 干旱胁迫对樟子松针叶膜脂成分的影响

表 1指出, 随干旱胁迫加强, 膜脂不饱和指数呈下降趋势, 饱和脂肪酸含量上升, 这与1989年尹田夫在大豆上的实验结论一致。樟子松针叶中饱和脂肪酸主要是由棕榈酸(16-0)、硬脂酸(18-0)组成, 前者含量远大于后者, 如在对照中含量分别是22.36%和4.39%, 且在干旱过程中棕榈酸成分发生比较明显变化, 干旱至苗木水势低于-7 MPa, 棕榈酸含量为28.71%, 较对照22.36%上升了6.35%, 此时饱和脂肪酸含量由26.75%上升至35.89%, 上升了9.06%, 因此饱和脂肪酸含量变化主要由棕榈酸变化引起。樟子松针叶膜脂不饱和脂肪酸中亚麻酸成分(18-3)远大于其他不饱和成分, 干旱过程中IUFA水平变化与亚麻酸变化趋势一致(图 2)。即当苗木水势下降到-1.3 MPa, 18-3含量和IUFA稳定; 当水势下降到-3.8 MPa, 二者发生较明显变化, 分别由39.75和178.67下降至37.3和168.72;至水势低于-MPa, 二者继续下降。18-1百分含量在干旱过程中逐步上升。

2.3 干旱胁迫膜脂成分与MDA含量的变化

从图 3可知, 在干旱初期, 苗木受到明显水分胁迫, 水势下降到-1.3 MPa, MDA含量较对照上升38.23%, 膜脂受到损伤, IUFA没有发生明显的变化; 干旱到苗木水势为-3.8MPa, 针叶含水量下降至41.09%, 苗木受到严重水分胁迫含量上升为对照117.45的2.13倍, IUFA轻度下降, 干旱后期苗木走向死亡, IUFA水平明显下降, MDA含量有所下降但仍处于高水平。由此可见樟子松针叶在干旱整个过程中MDA含量与IUFA水平变化并无线性相关性, 这与前人(陈少裕, 1991)在甘蔗叶片上的干旱实验结果不一致。

2.4 膜脂过氧化与乙烯的产生

图 4指出苗木受到严重干旱胁迫走向死亡时, IUFA水平发生明显下降, 高含量MDA含量有所下降, 乙烯释放量明显上升, 乙烯的产生主要有两种途径:ACC途径和亚麻酸途径。从本实验结果推测, 樟子松致死点苗木针叶乙烯峰的产生可能是通过亚麻酸途径, 即膜脂过氧化作用产生, 从而降低植物细胞内的IUFA水平和MDA含量, 这一推测有待进一步验证。

3 讨论

干旱条件下植物组织中和H₂O₂大量积累, 和H₂O₂直接氧化细胞内许多成分, 但不能直接启动膜脂过氧化(Seel, 1992), 和H₂O₂通过Fenton反应产生OH, 从而启动膜脂过氧化(Mishra, 1993; 蒋明义等, 1996)。对活性氧清除系统的活力决定细胞对胁迫抗性的关键因素, 实验表明许多植物的抗旱性品种与植物内对活性氧的清除能力密切相关, SOD是植物体内清除氧自由基的重要保护酶, 作为膜保护的第一道防线, 催化反应, 主要定位于叶绿体、线粒体、和细胞质中。玉米(Malan, 1990)、棉花(Bowler, 1992)、水稻(许长成, 1996)体内SOD酶活性与其品种的抗旱性呈现显著正相关。本实验结果表明, 土壤干旱轻度胁迫下(苗木水势下降到-1.3MPa), 樟子松针叶SOD活性随胁迫时间延长呈上升趋势(图 1), 表明樟子松通过明显提高其保护酶SOD活性响应胁迫, 提高的清除能力, 但此时MDA含量仍有上升趋势, 证实了植物体类仅SOD水平提高无法独立完成保护作用。植物体类活性氧的清除是由两大类物质控制, 一类是保护酶类, 包括过氧化物酶, 过氧化氢酶等。另一类为抗氧化物质, 包括Vc、V_E、GSH等。酶保护系统和非酶保护系统协同作用下完成活性氧的清除。严重干旱胁迫下, SOD活性水平下降, 的清除能力减弱, 酶保护作用降低, 造成体内的累积, 此时MDA含量迅速上升(图 1), 进一步证明SOD是樟子松针叶清除氧自由基, 防止膜脂过氧化的重要保护酶。

细胞膜是脂双层结构, 膜蛋白(一些受体、酶、离子通道)在双层中不停地旋转和在脂双层中扩散, 这些结构是膜流动和分子发挥功能的必需条件。活性氧通过膜脂过氧化作用而引起膜脂分子结构的改变, 表现为烃碳-碳不饱和键的减少, 从而影响膜的流动性, 最终造成膜的破坏(Barry, 1993; 黄益民等, 1998)。膜脂过氧化重要产物之一是MDA。已有实验证明许多研究表明MDA含量与细胞膜相对透性呈良好的正相关。干旱引起细胞膜组分中饱和脂肪酸含量升高, 不饱和脂肪酸指数降低(尹田夫, 1989)。本实验结果与此结论一致表樟子松针叶在苗木水势下降到的胁迫下水平没有发生改变, 这与其耐旱性极强一致, 在严重胁迫苗木走向死亡下IUFA水平下降。一些研究结果表明IUFA水平下降是植物对干旱的一种适应(王洪春, 1981), 李锦树1983年又指出, 严重干旱胁迫下IUFA水平下降, 脂肪酸趋于饱和化, 这是旱害的表征之一。本实验结果支持后一结论, IUFA水平下降是由于土壤干旱导致了膜脂过氧化作用, 樟子松干旱胁迫到第30天, 细胞内MDA含量明显上升, 表明膜脂已发生过氧化, 而IUFA水平没有发生改变(图 2), 植物细胞内可能存在有膜脂修复系统, 抑制亚麻酸等不饱和脂肪酸成分的含量下降, 降低由膜脂过氧化引起的膜脂饱和化, 以适应新的水分条件。1991年陈少裕等的研究认为甘蔗叶片中不饱和脂肪酸C18-3、C16-1的相对含量的变化均于MDA含量变化呈极显著负相关, 本实验表明干旱樟子松针叶高含量MDA与IUFA和C18-3的下降一致, 但二者无线性相关。植物体内可能存在着MDA以外的膜脂过氧化物, 或直接生成乙烯, 从而在严重胁迫下降低MDA含量(图 4), 但樟子松致死点产生的乙烯是否经脂过氧化途径有待进一步实验验证