植物抗虫基因工程是现代生物技术领域的重要成果之一, 近几年来在这方面研究进展迅速, 即使在以研究难度较大的木本植物为实验材料的林木基因工程研究中, 也取得了重大进展。自从1987年Fillatti等人(1987)首次利用农杆菌对银白杨×大齿杨进行转化, 获得第一株林木转基因植株以来, 此方面的研究不断取得突破, 如McCown等, (1991)获得了抗舞毒蛾和天幕毛虫的银白杨×大齿杨的转基植株。自1989年起, 本实验室与中国科学院微生物研究所合作, 成功地将Bt杀虫蛋白基因转入欧洲黑杨, 筛选出抗鳞翅目食叶害虫舞毒蛾和杨尺蠖的杨树品种, 杀虫率高达76%以上。1991年又开展了Bt基因对欧美杨的转化研究(田颖川等, 1993; 王学聘等, 1997)。从以往的研究结果看出, Bt基因无疑是目前应用最为广泛和最有潜力的抗虫基因之一(Cho et al., 1992; Seong Lyul et al., 1992.; Rhim et al., 1990)。但是Bt基因在应用中也存在一些问题:Bt杀虫结晶蛋白抗虫谱较窄; 害虫易对杀虫结晶蛋白产生耐受性杀虫剂是一种复合杀虫剂而在以往的研究中往往只向受体植物转入单一的抗虫基因, 致使转基因植株的抗虫能力不强、抗虫性不持久。解决这一问题的理想方法就是将2个或2个以上不同类型的抗虫基因同时导入细胞, 这样能在很大程度上延缓昆虫抗性的发生。因为同时导入不同类型的抗虫基因, 不仅使害虫产生耐受性的机率大大降低, 而且也增强了杀虫活力。蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor, PI)是自然界含量最为丰富的蛋白种类之一, 能与昆虫消化道内的蛋白酶相互作用, 削弱或阻断蛋白酶对食物中蛋白质的消化。蛋白酶抑制剂和蛋白酶形成的复合体能使昆虫产生厌食反应, 最终导致昆虫的非正常发育, 甚至死亡(王志斌等, 1998)。目前已有多种蛋白酶抑制剂基因被克隆并先后分别被导入植物, 表现出良好的抗虫效果。以木本植物为材料的研究中, 也有成功的报道。例如, Iowa大学的研究者利用马铃薯中的蛋白酶抑制剂基因与NPTII基因构成嵌合基因, 以根癌农杆菌Ti质粒为载体, 对杨树进行转化, 获得了转基因植株(Klopfen tein et al., 1991)。与苏云金杆菌杀虫结晶蛋白相比, 蛋白酶抑制剂具有抗虫谱广, 对人畜无副作用及昆虫不易产生耐受性等特点, 但存在转基因植株中表达量低等弱点。本研究, 在以往研究的基础上, 通过农杆菌的Ti质粒的双元载体将这2个抗虫机制不同的基因同时导入杨树(欧洲黑杨), 通过这2个杀虫基因不同杀虫机理的协同作用, 提高受体植物的抗虫能力和增大抗虫的广谱性, 延缓或避免害虫对外源抗虫基因产生耐受性, 从而获得抗虫能力强且稳定的转基因杨树。同时为今后多元复合基因导入受体植株奠定研究基础。

1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌种和质粒

含杀虫结晶蛋白基因的植物表达载体含蛋白酶抑制剂基因的植物表达载体pBin437, 由中国科学院微生物研究所构建并提供。

1.1.2 受试昆虫

舞毒蛾(Lymantria dispar L.)幼虫由中国林业科学研究院林业研究所分子遗传室提供。

1.1.3 植物材料

欧洲黑杨(Populus nigra)组培苗, 由中国林业科学研究院林业研究所分子遗传室提供。

1.2 方法 1.2.1 中间载体的构建

具体方法和步骤见有关文献(田颖川等, 1993)。

1.2.2 杨树外植体的转化

转化方法为农杆菌介导的叶盘法。不定芽诱导培养基为MS+BA, 0.2mg/L+NAA0.02 mg/L, 生根培养基为1/2MS+NAA0.02 mg/L。

1.2.3 再生植株的分子生物学检测

(1) 用PCR分析:杨树DNA的制备采用CTAB法(Roger et al., 1988)。杨树叶片DNA 20~30 ng在20μL反应体积, dNTP 0.2 mmol/L, Taq DNA聚合酶0.2U, Bt基因或蛋白酶抑制剂基因特异引物各10 pmol.PCR反应条件为:94℃变性30 s, 55℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 重复30个循环。反应结束后扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检查。(2) Southern杂交分析:10μg杨树叶片DNA经Hind Ⅲ完全酶切后在0.8%琼脂糖凝胶上电泳分离, 用Hyband公司的真空转膜装置将DNA转到Zeta-probe膜上, 然后与α-³²P-dCTP标记Bt基因或PI基因探针杂交过夜(65℃)、膜经漂洗后在X-光胶片上进行放射性自显影。

1.2.4 植株抗虫活性的测试

每瓶放入30头1龄的舞毒蛾幼虫, 于20℃的人工气候箱饲养, 每2 d更换叶片1次, 同时观察和记录幼虫的取食、生长与存活状况, 10 d后统计幼虫的死亡率。

2 结果与分析 2.1 转基因杨树植株的分子生物学检测

以杨树植株叶片DNA为模板、分别用Bt基因和蛋白酶抑制剂基因的特异引物, 在20μL反应体系中进行PCR扩增, PCR产物的电泳结果表明5株转基因植株出现2条DNA片段, 其中1条与阳性对照DNA片段的大小一致, 而非转基因对照植株未扩增出任何DNA片段。初步证明外源Bt基因和蛋白酶抑制剂基因已整合到这些杨树的基因组DNA中(图 1)。

为了进一步证实外源基因在染色体内的整合, 对部分PCR阳性植株进行了Southern杂交分析以进一步分别检测Bt基因和PI基因在杨树基因组中的整合状况。

Southern杂交分析结果表明, 转Bt基因和PI基因杨树植株DNA的Hind Ⅲ酶切产物与PI基因探针杂交可产生大约6.5 kb和3.5 kb的2条杂交带, 而非转基因植株不产生任何杂交带(图 2.A)。说明PI基因已整合到杨树基因组DNA中, 并初步表明也有两个拷贝的整合。转Bt基因和PI基因杨树植株DNA的Hind Ⅲ酶切产物与Bt基因探针杂交可产生大约7.0 kb和3.0 kb的2条杂交带, 而非转基因植株不产生任何杂交带。表明这2条杂交带为插入的外源基因片段(图 2.B)。这一结果说明Bt基因已整合到杨树基因组DNA中, 并初步表明有两个拷贝的整合。

2.2 转基因植株的杀虫效应

用大田中转基因杨树的幼嫩叶片喂养舞毒蛾幼虫, 虫试结果表明, 转Bt基因植株的幼虫死亡率为40%以上; 转双基因植株的幼虫死亡率为100%;而对照植株的幼虫死亡率仅为0%~10% (表 1和图 3)。此外, 在实验过程中还观察到, 在这10 d期间取食双基因植株的幼虫死亡前, 出现麻痹, 活能力低下, 停止进食等症状。即使取食转基叶片的幼虫可能幸存下来, 也出现其生长发受到明显抑制的现象。

3 结论与讨论

根据PCR分析及Southern杂交分析的实验结果, 证明Bt基因已整合到杨树植株(No.1、No.2和No.3)基因组DNA中。同时也证明蛋白酶抑制剂基因也已整合到杨树植株(No.1和No.2)基因组DNA中, 说明转基因杨树植株(No.1和No.2)为转双抗虫基因杨树植株, 并初步表明各有两个拷贝的Bt基因和蛋白酶抑制剂基因的整合。

用转基因杨树的幼嫩叶片喂养舞毒蛾幼虫的虫试结果表明, 转单一Bt基因杨树和转双基因杨树对舞毒蛾幼虫均有毒性, 而且转双基因杨树对幼虫的毒性明显大于转单一Bt基因杨树。说明这2个基因在细胞内均能够有效地表达, 其表达产物对舞毒蛾幼虫具有较强的毒性。同时还说明这2种杀虫基因不同杀虫机理对幼虫具有协同毒害作用, 从而提高了转双基因杨树植株的抗虫作用。这说明转双抗虫基因植株的培育具有广阔的应用前景。