植物病原真菌所产生的毒素种类很多, 作用机理也各不相同。总的来说, 主要涉及以下几个方面:对细胞膜的影响; 对线粒体的影响; 对叶绿体的影响; 对细胞核和核糖体的影响等。本文将主要就松针褐斑病菌毒素对寄主细胞质膜系统的伤害及其机理进行分析研究, 试图从细胞膜的角度来揭示松针褐斑病菌毒素的致病机理。

1 材料和方法 1.1 试验材料 1.1.1 植物材料

一年生湿地松针叶(采自本校树木园试验地), 湿地松愈伤组织。

1.1.2 毒素粗提液

用MS液体培养基培养松针褐斑病菌至产孢, 经抽滤除去菌丝和孢子后旋转蒸干, 加入甲醇充分振荡提取, 蒸去甲醇, 用0.4M蔗糖溶液恢复至原浓度即得。

1.1.3 所用试剂

0.4M蔗糖溶液(去离子水配制); 磷酸缓冲液(PBS, pH=7), Tris缓冲液(pH=8); 0.5%硫代巴比妥酸(TBA)溶液(20%的三氯乙酸配制); 氯仿、石油醚(60℃~90℃)、三氟化硼(BF₃)、正己烷、无水Na₂SO₄, 以上都为AR级, 南京化学试剂厂生产; 重蒸甲醇(将普通AR级甲醇加入碘和镁条后于甲醇沸点回流, 所得蒸出液即为无水重蒸甲醇); 100mM/L的Tiron溶液(Sigma公司产品)。

1.2 试验方法 1.2.1 细胞显微结构变化的观察

用毒素粗提液(0.4M蔗糖溶液配制, 维持一定的渗透压)处理愈伤组织, 以不含毒素的愈伤组织蔗糖悬浮液为对照, 2d后用光学显微镜观察细胞结构的变化(周毓君等, 1995; 王广金等, 1997; 陈捷等, 1997; 高必达, 1993)。

1.2.2 寄主细胞膜系统超氧阴离子自由基含量变化的测定

取新鲜幼嫩的愈伤组织, 用毒素粗提液为处理, 不含毒素的蔗糖液为对照, 分别作用0.5、1、2、4、7、14及24h后, 各取0.8mL的悬浮液, 加入0.1mL浓度为100mM的Tiron溶液和0.1mL Tris缓冲液(pH=8)使混合液的pH值达到7.5, 充分混匀后, 用玻璃毛细管吸取混合液, 将此毛细管一端封闭后置于石英样品管中, 插入JES-FE-3AX型ESR波谱仪的样品腔中, 先在无光照条件下测定自由基的含量, 扫描30次后得波谱D; 再用紫外线照射样品腔, 1min后测定自由基的含量, 得波谱L。在所得波谱中任选一峰, 用峰绝对高度的大小来表示自由基含量的多少(靳月华等, 1992; 林植芳等, 1984; 1988;宋纯鹏等, 1992; 1991;陈少裕等, 1991)。波谱记录条件:磁场强度3300G, 微波频率9.22GHz, 微波功率1mW, 调制频率100KHz, 调制幅度0.5G, 时间常数0.3s, 放大倍数2.5×10³, 扫描宽度10G。

1.2.3 寄主细胞膜脂脂肪酸组成分析

称取2 g湿地松愈伤组织, 用毒素粗提液分别处理2、4、12、24、48、72h后用沸水浴加热5min以灭活磷脂酶。将灭活后的愈伤组织用氯仿、甲醇(体积比为1:2)浸提24h, 取上清液, 残留物用1个体积的氯仿洗涤后离心, 取上清液, 合并两次上清液, 加入1个体积的1%NaCl溶液, 混合后进行液液分层, 待分层后取氯仿层, 过无水Na₂SO₄柱。将氯仿层于50℃下用旋转蒸发器真空旋转蒸发, 直至基本蒸干, 加入等体积相互饱和的甲醇与60℃~90℃石油醚重新进行液液分层, 取甲醇层, 将上面的石油醚层用甲醇再萃取一次, 合并甲醇萃取液, 加入石油醚进行萃取除去中性脂等杂质, 共2次, 弃石油醚层, 得甲醇层, 用真空旋转蒸发浓缩至干, 加入10%的BF₃无水甲醇溶液, 密封后于80℃下甲酯化1h, 冷却后加入2mL蒸馏水, 用正已烷萃取3次, 合并萃取液, 过Na₂SO₄柱过滤除水, 抽真空挥去正已烷浓缩至约30μL, 用惠普5890型气相色谱仪(美国惠普公司生产)进行分析(宋凤鸣等, 1989; 陈军等, 1990; Doke et al, 1985; Gonner et al, 1993; Kim et al, 1988; Klotz et al, 1988; Miller et al, 1975; Nurnberger et al, 1994); 色谱柱:FFAP毛细管柱(日本产); 柱温:顺序升温; 进样器温度:240℃; 检测器温度:240℃; 柱前压:1kg。

1.2.4 丙二醛(MDA)含量的测定

称取湿地松愈伤组织1.00 g, 毒素粗提液为处理, 不含毒素的蔗糖液为对照, 分别作用0、2、4、8、12、24、48 h后用蒸馏水快速离心洗涤4次, 依次加入5 mL PBS (pH=7)缓冲液和2 mL 0.5%的硫代巴比妥酸(TBA)溶液(含10%的三氯乙酸), 于沸水浴上反应30 min后, 立即置于冰浴冷却, 1500 rpm下离心1 min, 取上清液于535nm和600nm下721型分光光度计测定吸收值(OD值), 用OD (535~600 nm)值表示MDA含量(陈少裕, 1991; 陈贵等, 1991; 许长成等, 1992)。

1.2.5 电导率的测定

(1) 称取0.5g湿地松幼嫩愈伤组织, 用毒素粗提液(0.4M蔗糖溶液配制)为处理, 以不含毒素的蔗糖液为对照, 分别作用3、6、9、12、24h后, 用去离子水快速离心洗涤4次, 悬浮于20mL的0.4M蔗糖溶液中, 用DDS-11A型电导仪测其电导离D₁, 然后于120rpm的转速下振荡2h, 测其电导率D₂, 最后将此愈伤组织悬浮液于沸水浴中加热10min, 冷却至室温, 测其电导率D₃。愈伤组织细胞伤害率%= (D₂-D₁) /D₃ (Beffagna et al, 1997; Chil et al, 1996; Damann et al, 1974; Gardner et al, 1973; Holden et al, 1984; Kimber et al, 1984; Wu et al, 1989)。(2)称取0.5 g一年生湿地松针叶, 用毒素粗提液(不含蔗糖)为处理, 以蒸馏水为对照, 针叶叶鞘下端0.5 cm浸于溶液中, 分别作用12、24、48、72、96、120 h后取出, 用蒸馏水及去离子水洗涤干净后剪成0.5 cm小段, 测其电导率E₁, 然后于120 rpm的转速下振荡2 h, 测其电导率E₂, 最后于沸水浴中加热10 min, 冷却至室温, 测其电导率E₃。针叶伤害率%= (E₂-E₁) /E₃。

2 试验结果

湿地松愈伤组织经毒素粗提液处理两天后, 细胞逐渐变成褐色, 原生质中充满许多膨大的泡囊; 而对照细胞仍为淡黄色, 胞质中有少许细小的泡囊。

ESR检测结果(图 1)表明, 愈伤组织经毒素处理1~2 h内就可检测到自由基信号的存在, 且随着作用时间的延长, D/L (暗光比)值逐渐增大, 细胞所受伤害也越来越重, 其中又以4~7 h内为最大, 但若作用时间超过24 h则又检测不到信号的存在。而在对照中, 只有作用时间为2 h的那一组检测到了信号的存在(其D/L值为0.2925, 远小于相应的处理0.422), 在此前后又都检测不到。因此, 用病菌毒素代替病原与寄主愈伤组织相互作用可诱使寄主体内产生超氧阴离子自由基, 继而有可能诱发一系列过氧化反应而造成对寄主的伤害。

毒素处理后愈伤组织细胞膜脂脂肪酸变化的检测结果见图 2, 从图 2可见不饱和脂肪酸C18:3与C18:2的变化趋势相同, 但与饱和脂肪酸C18:0的变化趋势正相反。寄主细胞受毒素作用后, 诱使膜脂发生过氧化反应, 膜脂脂肪酸组成也随之而变。在检测的几种脂肪酸中, 随着毒素处理时间延长, 毒害作用加剧, C18:0含量总体上呈增加趋势, 而与之相对应的C18:2与C18:3则呈减少之势。

丙二醛(MDA)含量测定结果(图 3)表明, 作用时间2 h时, 处理与对照相比不明显, 两者仅相差2.56%;而作用时间超过4 h后, 两者相比就较显著, 其中4、8、12、24和48 h处理分别比对照大39.05%、21.63%、24.04%、28.71%和20.23%, 并于4 h左右达最大值。本试验结果从膜脂过氧化最终产物MDA含量变化角度揭示了毒素处理可诱使寄主细胞膜脂发生过氧化反应, 最终造成对膜的伤害。

毒素处理对寄主细胞离子渗漏的影响见表4和表5。对于愈伤组织, 作用时间在3h以内时, 处理与对照相比两者离子渗漏情况相差不明显; 当作用时间为3~6h时, 两者相差就变得逐渐明显并于6h左右达到最大值; 此后, 随着作用时间的延长, 由于对照中寄主细胞老化等原因的影响, 两者相差又逐渐变得不明显起来, 但总体来说, 毒素处理都较对照严重。在针叶试验中也得到了类似的结果, 作用时间在12h以内, 毒系处理的离子渗漏情况就比对照明显; 在12~24h内两者相对差值逐渐变大并于24h左右达到最大值。

3 结论和讨论

本试验从膜的角度出发, 较为系统地研究了松针褐斑病菌毒素对寄主细胞膜体系的显微结构、超氧阴离子自由基、膜脂脂肪酸组成、MDA含量及离子渗漏的影响, 运用膜脂脂肪酸分析技术和ESR技术从膜的角度初步阐明了毒素的致病机理。

毒素可促使寄主愈伤组织细胞原生质泡囊化, 此现象在其它毒素致病过程中也很普遍, 甚至用电子显微镜还可观察到线粒体、叶绿体等细胞超微结构的泡囊化现象, 这是细胞受到伤害后在显微或亚显微结构上所表现出的一种症状。

从以上试验结果可见, 和对照相比, 毒素作用后2 h以内就可检测到寄主细胞体内超氧阴离子自由基的生成, 在4 h内产生比对照高得多的MDA, 6 h内则可发生严重的离子渗漏现象。在所检测的膜脂脂肪酸中, C18:0、C18:2及C18:3也随之发生规律性的变化, 表现为不饱和脂肪酸C18:2与C18:3的变化趋势正好与具有相同碳原子数的饱和脂肪酸C18:0相反。因此, 用松针褐斑病菌毒素代替病原菌对寄主进行作用可诱导寄主植物产生超氧阴离子自由基, 引发一系列自由基反应, 促使寄主细胞膜脂脂肪酸组成发生变化, MDA含量增加, 细胞膜破损, 发生严重的离子渗漏现象, 最后导致细胞死亡。

在用ESR技术检测超氧阴离子自由基试验中, 对照部分仅2 h的那一组检测到了自由基信号的存在, 其原因有待进一步研究。至于24 h后无论毒素还是对照都检测不到ESR信号的存在, 其原因可能是超氧阴离子自由基只是寄主对毒素的最初反应, 随着作用时间的延长, 寄主细胞中自由基产生的量逐渐减少, 且此自由基为整个自由基反应的瞬间产物, 寿命很短, 在引发一系列其它自由基反应后, 其本身难于在体内积累, 固毒素作用时间超过一定的时限就检测不到该自由基ESR信号的存在。进行MDA含量测定时, 和对照相比于4 h左右毒素处理达到了最大值; 此后随着时间的延长, 由于对照中细胞老化等原因的影响, 虽然毒素处理的MDA含量绝对值都较对照为高, 但两者相对差值却逐渐变小。另外可能是因为MDA的不稳定性等方面的影响, 无论处理或是对照, 测得的绝对数值都于作用时间为4 h时达到最大, 此后的数值总较其要小。在愈伤组织离子渗漏试验中也出现了类似的现象, 6 h左右处理比对照高达130.94%, 以后随着作用时间的延长, 两者相对差值越来越小, 但毒素处理仍然要高于对照。其中在12h时测得的数值比其它时间段都大得多, 究其原因可能是因为毒素处理后洗涤不充分, 残留有较多杂质离子的缘故。若忽略该组数据可发现随着时间的推移各组数值呈递减趋势, 本人认为可能也是因为洗涤的缘故, 每次处理后的离心洗涤都将去掉许多在此期间渗漏的离子, 而胞内离子库总量是有限的, 因而各组渗漏率随着作用时间的推移呈递减之势变化; 在针叶试验中也有类似情况, 12 h时测得的渗漏率绝对值最大, 24 h时处理与对照相差最大, 此后由于对照针叶老化等原因影响, 两者相对差值逐渐变小; 在24~48 h内毒素处理的针叶出现了病斑, 也容易造成可溶性离子的变化和洗涤时的渗漏, 故在此时间段以后的各组离子渗漏率都随作用时间呈递减之势变化。另外在膜脂脂肪酸测定试验中, 由于超氧阴离子自由基诱发的膜脂过氧化反应是一个复杂的过程, 因此饱和及不饱和脂肪酸含量的变化并不仅仅简单地表现为增加或减少的关系, 而是表现为不饱和脂肪酸C18:2、C18:3与饱和脂肪酸C18:0的变化趋势正好相反。

本部分内容只是从细胞质膜的角度初步探讨了松针褐斑病菌毒素的致病机理, 至于其它一些更为复杂的生理生化反应有待进一步研究。