无花果(Ficus carica)为桑科(Moraceae)无花果属(Ficus)植物，是人类最早栽培的果树之一(Mordenchai et al., 2006)。无花果不仅具有较高的营养价值，还具有多种医疗效果。另外，还可以加工成保健饮料、酒、茶、果干、果脯、果酱、罐头、果汁等产品，市场供不应求。近年来，无花果与草莓、猕猴桃等同为新开发的第三代水果。另外，无花果树在净化空气和绿化方面也有很好的作用。但目前我国无花果只在新疆、江苏、山东及以南的部分省区有少量种植，而且品种资源较为混乱，给种植者带来较大的经济损失。所以加强对无花果资源的鉴定和管理具有重要的现实意义。

近年来，随着分子生物学的发展，DNA分子标记技术得到迅速开发和广泛应用，已成为植物遗传资源研究和辅助育种的重要手段，如种质鉴定、遗传多样性研究、性状标记、基因作图(翁尧富等，2001；Teng et al., 2002；苏晓华等，2000；Silfverberg-Dilworth et al., 2006)等。目前，分子标记技术在无花果研究方面的应用多以资源的多样性分析为主(王亮等，2007；Hepaksoy et al., 2006；Khadari et al., 2005；Luigi et al., 2005；Mars，2003；Sadder et al., 2006)，尚无关于其生物学性状标记方面的报道。无花果的叶形等生物学性状是其分类和种质鉴定的重要依据，如山东半岛普遍栽培品种‘青皮’为基部心形叶形，而‘布兰瑞克’为基部非心形叶形。因此，本研究将利用RAPD技术筛选与叶形性状连锁的分子标记，并对其进行SCAR转换，以期得到稳定、可靠的标记，为资源的收集和鉴定提供有效手段。

1 材料与方法 1.1 材料

以青岛农业大学园艺学院果树种质资源与遗传育种研究室收集到的58份无花果资源(划归为23个基因型)为试材(王亮等，2007)。其中，基部心形叶资源16份，分属于7个基因型；基部非心形叶资源42份，分属于16个基因型。

1.2 方法

1) 基因组DNA提取及RAPD-PCR扩增与产物检测 同王亮等(2007)的方法。共筛选了51个随机引物。

2) RAPD标记片段的回收、克隆与测序 用玻璃珠(Silver Beads)DNA回收试剂盒(购自上海Sangon公司)从琼脂糖凝胶上回收特异标记DNA片段。将其连接到pGEM-T easy vector(Promega公司)，用热激法将其转化到大肠杆菌细胞，扩大繁殖。用碱法提取质粒DNA，通过酶切鉴定克隆片段的正确性。将含克隆质粒的菌液送至上海Sangon公司测序。

3) RAPD标记向SCAR标记的转换 根据回收RAPD片段的测序结果，利用Primer Premier 5.0软件设计特异PCR引物序列。引物的合成由上海Sangon公司完成。用特异性引物组合对不同叶形无花果基因组进行扩增。总反应体系25 μL，内含模板DNA 25 ng、MgCl₂ 3.0 mmol·L^-1、dNTPs 0.2 mmol·L^-1、10×buffer 2.5 L、正反向引物各0.2 μmol·L^-1、Taq酶1 U。反应混合物用15 μL石蜡油覆盖，反应在0.2 mL PCR薄壁反应管内进行。Taq酶、10×buffer、MgCl₂为大连宝生物公司产品；dNTPs为上海Sangon公司产品。

SCAR-PCR扩增在MJ Research PTC-200 PCR扩增仪上进行。反应程序为：94 ℃预变性4 min；然后是94 ℃变性35 s，复性60 s，72 ℃延伸90 s，共25个循环；最后72 ℃延伸5 min。复性温度根据引物退火温度值不同适当调整。扩增产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析 2.1 无花果叶形相关的RAPD标记

在分析无花果资源多样性的过程中，通过对51个RAPD引物的筛选，发现随机引物S₂₀₈₂(5′-ACGCCTGTAG-3′)扩增出的约为1 600 bp左右的片段可在不同叶形(基部心形叶/基部非心形叶)的种质资源间表现出多态性，这是一个与基部非心形叶形性状相连锁的标记(图 1)。叶形的分类参照IPGRI(International Plant Genetic Resources Institute)和CIHEAM(International Centre for Advanced Mediterranean Agronomic Studies)的标准(IPGRI and CIHEAM, 2003)。

2.2 RAPD标记片段的回收、克隆及酶切鉴定

对上述特异片段进行回收、克隆。由于在回收PCR产物时，易受一些非特异性带的干扰，致使克隆片段有可能不是目标带，因此需对所获得的重组质粒进行酶切检测，以确认克隆片段的正确性。如果酶切结果证明插入片段与PCR扩增的标记片段大小一致，那么说明目标片段已被成功克隆。如果酶切结果显示插入的片段小于PCR扩增的标记片段，则可能说明克隆片段不正确，也可能是该特异片段内含有酶切位点，使该片段被切断而出现2个或更多的短片段(此时，各片段长度之和应等于目标片段长度)。本研究中，在对引物S₂₀₈₂扩增出的特异片断的重组质粒进行酶切鉴定时，经过多次重复得到的酶切结果都是1条约1 200 bp和1条约400 bp的条带。初步认为这条特异片断的内部具有EcoRⅠ的酶切位点，将特异片段酶切出1个长片段和1个短片段。

2.3 RAPD标记片段序列

测序结果(图 2)表明，来自引物S₂₀₈₂的标记片段长度为1 640 bp，在该片段的两端均能找到相应的随机引物或其对应的互补结合序列(序列两端的黑体部分)。通过对S_2082-1640全序列的分析发现，在序列的1 187 ~1 192 bp位置存在EcoRⅠ的酶切位点(序列中斜体并下划线部分)，这也证实了最初的推测。

2.4 RAPD标记向SCAR标记的转换

根据标记片段S_2082-1640测序结果，利用Primer Premier 5.0软件设计上游引物和下游引物(位置对应于序列两端的下划线部分)。SCAR-F：5′-ACG CCT GTA GGT GGA CAT GTT G-3′；SCAR-R：5′-ACG CCT GTAGTA ATA ACT GGA T-3′。

在SCAR-PCR扩增体系中，除MgCl₂浓度、Taq酶浓度、循环次数等条件外，退火温度对扩增结果起着更为重要的作用。退火温度的选择，可以根据引物的长度和其G+C含量确定。当长度在15~25 bp之间时，引物的退火温度可通过T_m=4×(G+C)+2×(A+T)计算得到，式中，G，C，A，T分别为引物中G，C，A，T的含量。在T_m允许的范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物和模板之间的非特异结合，从而提高PCR反应的特异性。SCAR-F和SCAR-R的T_m分别为61.94 ℃和56.35 ℃。因此，本试验设置了10个复性温度梯度，即55，55.3，55.9，56.7，57.8，59.3，61，62.4，63.5，64.3 ℃，总反应体系和其余条件均不变。结果表明，后3种温度下均可得到理想的扩增效果。后经试验确定，SCAR-PCR扩增体系为：MgCl₂ 3.0 mmol·L^-1、Taq酶1 U。反应程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 35 s，62 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，运行25个循环；最后72 ℃延伸5 min。用这对引物，在不同叶形样品上进行PCR扩增，结果发现标记片段S_2082-1640仍表现出原有的多态性(图 3)。在58份供试种质上的分析结果，与实际情况完全吻合。

3 结论与讨论

RAPD标记技术因成本低、技术简单，可实现自动化，不需要制备探针和进行杂交等特点而被广泛应用，但RAPD扩增易受反应条件的影响，其结果常表现不稳定、重复性差。若将RAPD标记转化为特异的SCAR标记，可以有效地解决这一问题。然而，RAPD标记转换为SCAR标记的成功率很低，一般为15%左右(Horejsi et al., 1999)。关于RAPD标记转换为SCAR标记后多态性消失的现象，目前还没有一个明确的原因。本研究过程中，也曾获得一个与无花果基部心形叶形性状相连锁的RAPD标记S_2104-1614，但该标记转换成SCAR标记后多态性消失，无法用于辅助选择。尽管如此，在果树上，还是从RAPD标记开发出了多个与重要性状相关的SCAR标记，如苹果(Malus domestica)的柱型性状(Tian et al., 2004)、苹果的抗黑星病性状(Gianfranceschi et al., 1996；Tartarini et al., 1999；Yang et al., 1996)、梨(Pyrus communis)的矮化性状(贾彦利等，2007)、桃(Prunus persica)果实的有毛/无毛性状(姜立杰等，2005)以及葡萄(Vitis vinifera)的无核性状(杨英军等，2002；Lahogue et al., 1998)等。这些标记将在果树性状的分子标记辅助选择中发挥重要作用。在本试验中，获得了1个与无花果基部非心形叶形连锁的RAPD标记S_2082-1640，并将其成功转化为SCAR标记。该项研究成果，将为无花果种质资源的收集和鉴定提供有效手段，如在落叶休眠期可作为判断种质类型的分子依据。

普通型无花果无法进行有性杂交获得种子，长期以来是靠无性方法进行繁殖的，新的基因型的产生只能来自突变(体细胞变异)。因此，在普通型无花果上无法获得靠基因重组产生的广泛变异，也无法通过杂交途径获得针对目标性状的分离群体。但在果树上，也有一些用大量品种作为标记筛选和分析群体的报道(Cheng et al., 1996；王跃进等，2002)，本试验在无花果叶形标记时，也借鉴了这一思路。开发出的标记可在未来的种质鉴定工作中进一步得到验证。