文章信息
- 王亮, 王彩虹, 田义轲, 何晓薇, 王辉.
- Wang Liang, Wang Caihong, Tian Yike, He Xiaowei, Wang Hui
- 无花果叶形性状的SCAR分子标记
- A SCAR Molecular Marker Related to Leaf Shape of Fig(Ficus carica)
- 林业科学, 2009, 45(6): 158-161.
- Scientia Silvae Sinicae, 2009, 45(6): 158-161.
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文章历史
- 收稿日期:2008-05-14
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作者相关文章
无花果(Ficus carica)为桑科(Moraceae)无花果属(Ficus)植物,是人类最早栽培的果树之一(Mordenchai et al., 2006)。无花果不仅具有较高的营养价值,还具有多种医疗效果。另外,还可以加工成保健饮料、酒、茶、果干、果脯、果酱、罐头、果汁等产品,市场供不应求。近年来,无花果与草莓、猕猴桃等同为新开发的第三代水果。另外,无花果树在净化空气和绿化方面也有很好的作用。但目前我国无花果只在新疆、江苏、山东及以南的部分省区有少量种植,而且品种资源较为混乱,给种植者带来较大的经济损失。所以加强对无花果资源的鉴定和管理具有重要的现实意义。
近年来,随着分子生物学的发展,DNA分子标记技术得到迅速开发和广泛应用,已成为植物遗传资源研究和辅助育种的重要手段,如种质鉴定、遗传多样性研究、性状标记、基因作图(翁尧富等,2001;Teng et al., 2002;苏晓华等,2000;Silfverberg-Dilworth et al., 2006)等。目前,分子标记技术在无花果研究方面的应用多以资源的多样性分析为主(王亮等,2007;Hepaksoy et al., 2006;Khadari et al., 2005;Luigi et al., 2005;Mars,2003;Sadder et al., 2006),尚无关于其生物学性状标记方面的报道。无花果的叶形等生物学性状是其分类和种质鉴定的重要依据,如山东半岛普遍栽培品种‘青皮’为基部心形叶形,而‘布兰瑞克’为基部非心形叶形。因此,本研究将利用RAPD技术筛选与叶形性状连锁的分子标记,并对其进行SCAR转换,以期得到稳定、可靠的标记,为资源的收集和鉴定提供有效手段。
1 材料与方法 1.1 材料以青岛农业大学园艺学院果树种质资源与遗传育种研究室收集到的58份无花果资源(划归为23个基因型)为试材(王亮等,2007)。其中,基部心形叶资源16份,分属于7个基因型;基部非心形叶资源42份,分属于16个基因型。
1.2 方法1) 基因组DNA提取及RAPD-PCR扩增与产物检测 同王亮等(2007)的方法。共筛选了51个随机引物。
2) RAPD标记片段的回收、克隆与测序 用玻璃珠(Silver Beads)DNA回收试剂盒(购自上海Sangon公司)从琼脂糖凝胶上回收特异标记DNA片段。将其连接到pGEM-T easy vector(Promega公司),用热激法将其转化到大肠杆菌细胞,扩大繁殖。用碱法提取质粒DNA,通过酶切鉴定克隆片段的正确性。将含克隆质粒的菌液送至上海Sangon公司测序。
3) RAPD标记向SCAR标记的转换 根据回收RAPD片段的测序结果,利用Primer Premier 5.0软件设计特异PCR引物序列。引物的合成由上海Sangon公司完成。用特异性引物组合对不同叶形无花果基因组进行扩增。总反应体系25 μL,内含模板DNA 25 ng、MgCl2 3.0 mmol·L-1、dNTPs 0.2 mmol·L-1、10×buffer 2.5
SCAR-PCR扩增在MJ Research PTC-200 PCR扩增仪上进行。反应程序为:94 ℃预变性4 min;然后是94 ℃变性35 s,复性60 s,72 ℃延伸90 s,共25个循环;最后72 ℃延伸5 min。复性温度根据引物退火温度值不同适当调整。扩增产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。
2 结果与分析 2.1 无花果叶形相关的RAPD标记在分析无花果资源多样性的过程中,通过对51个RAPD引物的筛选,发现随机引物S2082(5′-ACGCCTGTAG-3′)扩增出的约为1 600 bp左右的片段可在不同叶形(基部心形叶/基部非心形叶)的种质资源间表现出多态性,这是一个与基部非心形叶形性状相连锁的标记(图 1)。叶形的分类参照IPGRI(International Plant Genetic Resources Institute)和CIHEAM(International Centre for Advanced Mediterranean Agronomic Studies)的标准(IPGRI and CIHEAM, 2003)。
对上述特异片段进行回收、克隆。由于在回收PCR产物时,易受一些非特异性带的干扰,致使克隆片段有可能不是目标带,因此需对所获得的重组质粒进行酶切检测,以确认克隆片段的正确性。如果酶切结果证明插入片段与PCR扩增的标记片段大小一致,那么说明目标片段已被成功克隆。如果酶切结果显示插入的片段小于PCR扩增的标记片段,则可能说明克隆片段不正确,也可能是该特异片段内含有酶切位点,使该片段被切断而出现2个或更多的短片段(此时,各片段长度之和应等于目标片段长度)。本研究中,在对引物S2082扩增出的特异片断的重组质粒进行酶切鉴定时,经过多次重复得到的酶切结果都是1条约1 200 bp和1条约400 bp的条带。初步认为这条特异片断的内部具有EcoRⅠ的酶切位点,将特异片段酶切出1个长片段和1个短片段。
2.3 RAPD标记片段序列测序结果(图 2)表明,来自引物S2082的标记片段长度为1 640 bp,在该片段的两端均能找到相应的随机引物或其对应的互补结合序列(序列两端的黑体部分)。通过对S2082-1640全序列的分析发现,在序列的1 187 ~1 192 bp位置存在EcoRⅠ的酶切位点(序列中斜体并下划线部分),这也证实了最初的推测。
根据标记片段S2082-1640测序结果,利用Primer Premier 5.0软件设计上游引物和下游引物(位置对应于序列两端的下划线部分)。SCAR-F:5′-ACG CCT GTA GGT GGA CAT GTT G-3′;SCAR-R:5′-ACG CCT GTAGTA ATA ACT GGA T-3′。
在SCAR-PCR扩增体系中,除MgCl2浓度、Taq酶浓度、循环次数等条件外,退火温度对扩增结果起着更为重要的作用。退火温度的选择,可以根据引物的长度和其G+C含量确定。当长度在15~25 bp之间时,引物的退火温度可通过Tm=4×(G+C)+2×(A+T)计算得到,式中,G,C,A,T分别为引物中G,C,A,T的含量。在Tm允许的范围内,选择较高的退火温度可大大减少引物和模板之间的非特异结合,从而提高PCR反应的特异性。SCAR-F和SCAR-R的Tm分别为61.94 ℃和56.35 ℃。因此,本试验设置了10个复性温度梯度,即55,55.3,55.9,56.7,57.8,59.3,61,62.4,63.5,64.3 ℃,总反应体系和其余条件均不变。结果表明,后3种温度下均可得到理想的扩增效果。后经试验确定,SCAR-PCR扩增体系为:MgCl2 3.0 mmol·L-1、Taq酶1 U。反应程序:94 ℃ 4 min;94 ℃ 35 s,62 ℃ 60 s,72 ℃ 90 s,运行25个循环;最后72 ℃延伸5 min。用这对引物,在不同叶形样品上进行PCR扩增,结果发现标记片段S2082-1640仍表现出原有的多态性(图 3)。在58份供试种质上的分析结果,与实际情况完全吻合。
RAPD标记技术因成本低、技术简单,可实现自动化,不需要制备探针和进行杂交等特点而被广泛应用,但RAPD扩增易受反应条件的影响,其结果常表现不稳定、重复性差。若将RAPD标记转化为特异的SCAR标记,可以有效地解决这一问题。然而,RAPD标记转换为SCAR标记的成功率很低,一般为15%左右(Horejsi et al., 1999)。关于RAPD标记转换为SCAR标记后多态性消失的现象,目前还没有一个明确的原因。本研究过程中,也曾获得一个与无花果基部心形叶形性状相连锁的RAPD标记S2104-1614,但该标记转换成SCAR标记后多态性消失,无法用于辅助选择。尽管如此,在果树上,还是从RAPD标记开发出了多个与重要性状相关的SCAR标记,如苹果(Malus domestica)的柱型性状(Tian et al., 2004)、苹果的抗黑星病性状(Gianfranceschi et al., 1996;Tartarini et al., 1999;Yang et al., 1996)、梨(Pyrus communis)的矮化性状(贾彦利等,2007)、桃(Prunus persica)果实的有毛/无毛性状(姜立杰等,2005)以及葡萄(Vitis vinifera)的无核性状(杨英军等,2002;Lahogue et al., 1998)等。这些标记将在果树性状的分子标记辅助选择中发挥重要作用。在本试验中,获得了1个与无花果基部非心形叶形连锁的RAPD标记S2082-1640,并将其成功转化为SCAR标记。该项研究成果,将为无花果种质资源的收集和鉴定提供有效手段,如在落叶休眠期可作为判断种质类型的分子依据。
普通型无花果无法进行有性杂交获得种子,长期以来是靠无性方法进行繁殖的,新的基因型的产生只能来自突变(体细胞变异)。因此,在普通型无花果上无法获得靠基因重组产生的广泛变异,也无法通过杂交途径获得针对目标性状的分离群体。但在果树上,也有一些用大量品种作为标记筛选和分析群体的报道(Cheng et al., 1996;王跃进等,2002),本试验在无花果叶形标记时,也借鉴了这一思路。开发出的标记可在未来的种质鉴定工作中进一步得到验证。
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