近年来，关于寄生植物吸器(Haustorium)形成的化学信号调控机制的研究受到了广泛关注(Keyes et al., 2001；胡飞等，2003；Bouwmeester et al., 2003；Matúšová et al., 2005；Sato et al., 2005；Tomilov et al., 2005；Bais et al., 2006；Kusumoto et al., 2007)。吸器在寄生植物与寄主植物之间起着连接纽带的作用，也是寄生植物从寄主植物获得营养物质的通道(胡飞等，2003)。目前，普遍认为诱导寄生植物吸器形成的化学信号物质主要包括醌类、酚酸类和类黄酮类(Keyes et al., 2001；Bouwmeester et al., 2003；Matúšová et al., 2005)，其作用机理可能是寄生植物种子萌发后，形成的芽管释放H₂O₂和酚氧化酶将寄主根系释放的酚类化合物转化成醌类化合物，通过这一氧化还原机制诱导寄生植物形成吸器(Kim et al., 1998；Keyes et al., 2001)。同时，研究发现植物激素对寄生植物种子萌发和吸器形成以及发育过程也具有一定促进作用(姚东瑞等，1994；Tomilov et al., 2005)。

肉苁蓉(Cistanche deserticola)为列当科(Orobanchaceae)肉苁蓉属(Cistanche)多年生专性根寄生植物，以往对肉苁蓉的研究主要集中在种子活力(许月英等，1993)和组织培养(欧阳杰等，2002)等方面。近年来，对肉苁蓉种子萌发(牛东玲等，2006)以及种子后熟过程中内源激素含量的变化(盛晋华等，2006)等方面进行了大量研究。本课题组研究了变温诱导对肉苁蓉种子萌发的影响(张汝民，2008)，并对其寄主梭梭(Haloxylon ammodendron)根系分泌物进行了分离与鉴定(张汝民等，2006；2007)。但至今为止，关于化学诱导肉苁蓉种子萌发和吸器形成的研究未见报道。本文从化学物质诱导肉苁蓉种子萌发和形成吸器入手，观察了植物激素、醌类和酚酸类物质对肉苁蓉种子萌发及形成吸器过程的影响，为探明肉苁蓉种子萌发和形成吸器的信号调控物质提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 供试材料

肉苁蓉种子由内蒙古阿拉善盟林业科学研究所提供，2005年6—7月采自内蒙古阿拉善盟吉兰泰地区野生肉苁蓉植株上，采回的种子放置于低温冰箱(4℃左右)保存，试验于2005年9月—2007年6月进行。试验使用的化学试剂萘乙酸(NAA)、赤霉素(GA₃)、细胞分裂素(6-BA)、2，6-二甲氧基对苯醌(dimethoxy-p-benzoqinone，DMBQ)、对苯醌(p-benzoquinone，BQ)、间苯二酚(resorcin，RS)、阿魏酸(ferulic acid，FA)和对羟基苯甲酸(hydroxybenzoic acid，HA)均购于Sigma公司。

1.2 研究方法 1.2.1 种子处理及培养

筛选饱满的肉苁蓉种子，用蒸馏水冲洗干净，将肉苁蓉种子置于50 ℃的水浴锅中恒温处理1 h。然后，用解剖针剥离种皮，再用0.1%的HgCl₂消毒1.5 min，用无菌水清洗5~6次，将肉苁蓉种子分别接种在添加植物激素或化学诱导物质的MS培养基(pH值5.8)的培养皿中(Φ 9 cm)。每个培养皿中接种50粒种子，放入18 ℃±1 ℃培养箱中暗培养30天后。每隔2天在弱光下观察肉苁蓉种子形成芽管和吸器情况，按照《国际种子发芽规程》(ISTA 1996)芽管长为种子长度的1/2为萌发；培养到60天，统计肉苁蓉种子萌发率；培养70天，统计吸器形成的数量，用OLYMPUS-SZH10型体视显微镜拍照。每个处理3次重复。

1.2.2 植物激素处理试验设计

根据预试验结果，以MS培养基作为基本培养基，按照表 1添加不同浓度植物激素NAA、GA₃及6-BA，分别进行单因素和因素组合处理。单因素处理以不添加植物激素的MS培养基为对照。因素组合处理考虑植物激素间的交互作用，按照L₂₇3⁽¹³⁾的正交试验设计进行。

1.2.3 化学诱导物质处理试验设计

根据预试验结果，以添加植物激素试验结果最佳组合的MS培养基作为基本培养基，同时，按照表 2添加不同浓度的化学诱导物质DMBQ、RS、FA、BQ和HA分别进行单因素和因素组合处理。单因素处理以不添加化学诱导物质的MS培养基为对照。在单因素处理的基础上，选取能够诱导形成吸器的化学物质进行因素组合处理，并且考虑化学诱导物质间的交互作用，按照L₂₇3⁽¹³⁾的正交试验设计进行。

1.3 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2003处理，采用SPSS 13.0软件进行方差分析。

2 结果与分析 2.1 植物激素对肉苁蓉种子萌发的影响

在添加不同浓度植物激素的MS培养基上进行肉苁蓉种子培养，观察肉苁蓉种子萌发情况。单因素NAA和6-BA处理不能够诱导肉苁蓉种子萌发(表 3和图 1A)；2.9 μmol·L^-1和5.8 μmol·L^-1 GA₃对肉苁蓉种子萌发具有一定的促进作用(表 3和图 1B)。肉苁蓉种子培养50天左右，珠孔端呈乳黄色凸起，60天左右芽管长4 mm，其萌发率为3.3%~4.7%；而未萌发的种子珠孔端与接种时相比无任何变化(图 1A)。

表 4为3种植物激素NAA、GA₃和6-BA对肉苁蓉种子萌发正交试验结果。对表 4中数据进行单因素和交互作用直观分析可知，R_B＞R_A＞R_A×B＞R_C＞R_A×C＞R_B×C，即GA₃是影响肉苁蓉种子萌发的主要因素，其次为NAA和NAA×GA₃的交互作用；再根据K₁、K₂和K₃值的大小确定水平：依次为A(2)、B(3)和C(1)。对表 4中数据进行方差分析结果表明：影响肉苁蓉种子萌发差异极显著的植物激素为GA₃(P＜0.01)，其次为NAA和交互作用NAA×GA₃(P＜0.05)；因素6-BA、交互作用NAA×6-BA和GA₃×6-BA在正交试验中的作用均不明显(P>0.05)(表 5)。由此可知，诱导肉苁蓉种子萌发的最佳植物激素组合为2.9 μmol·L^-1 NAA+5.8 μmol·L^-1 GA₃+ 1.4 μmol·L^-1 6-BA。用添加该植物激素组合的MS培养基培养时，肉苁蓉种子萌发速度最快，萌发率最高为20.0%。

2.2 化学诱导物对肉苁蓉种子吸器形成的影响

在预试验中，将肉苁蓉种子培养在添加不同浓度和种类化学诱导物的MS培养基中，培养90天后5种化学诱导物处理均没有观察到种子萌发和吸器形成。以MS培养基添加最佳植物激素组合(2.9 μmol·L^-1 NAA+5.8 μmol·L^-1 GA₃ +1.4 μmol·L -1 6-BA)为基本培养基，同时添加不同浓度和种类化学诱导物，观察肉苁蓉种子萌发和吸器形成，结果见表 6。

3个浓度的单因素BQ和HA处理均没有观察到萌发的肉苁蓉种子形成吸器，10 μmol·L^-1 DMBQ、RS和FA单因素处理均可诱导萌发的肉苁蓉种子形成吸器，DMBQ处理吸器形成率为46.7%。种子培养35天左右肉苁蓉种子萌发长出芽管，50天左右芽管前端膨大形成吸器，吸器长度为种子的4倍(图 1C)。

根据单因素化学诱导物试验结果，选取能够诱导形成吸器的化学诱导物DMBQ、RS和FA进行正交试验(表 7)。对表 7中数据进行单因素和交互作用直观分析可知，R_A＞R_A×C＞R_A×B＞R_B＞R_C＞R_B×C，即DMBQ是影响吸器形成的主要因素，其次为交互作用DMBQ×RS和DMBQ×FA。对表 7中数据进行方差分析表明：影响吸器形成差异极显著的化学诱导物为DMBQ(P＜0.01)，其次是交互作用DMBQ×RS和DMBQ×FA(P＜0.05)，因素RS、FA和交互作用RS×FA在正交试验中的作用均不明显(P>0.05)(表 8)。由此可知，诱导萌发的肉苁蓉种子吸器形成的最佳化学诱导物组合为10 μmol·L^-1 DMBQ+50 μmol·L^-1 RS或10 μmol·L^-1 DMBQ+ 50 μmol·L^-1 FA。用该化学诱导物组合的MS培养基培养时，萌发的肉苁蓉种子全部可以形成吸器。

3 讨论 3.1 植物激素在诱导肉苁蓉种子萌发中的作用

由于肉苁蓉种子细小，结构特殊，加之其生境的特殊性(张汝民等，2008)，种子休眠的原因十分复杂，在自然条件下难以萌发(李天然，1996)。盛晋华等(2006)研究发现肉苁蓉种子经过层积处理种子内源脱落酸含量减少，采用适当浓度的GA₃可诱导肉苁蓉种子萌发形成芽管(表 3)，GA₃的增加可以抵消脱落酸的抑制作用；适当的NAA与GA₃组合可以提高肉苁蓉种子萌发(表 4)，NAA可改变膜的透性，从而使GA₃的作用得以实现，GA₃是肉苁蓉种子萌发过程中必需的激素。但植物激素不能使萌发的芽管进一步发育形成吸器。

3.2 化学物质在肉苁蓉种子萌发后形成吸器中的作用

自然状态下，寄主植物与寄生植物之间存在着广泛的地下信号交流。首先寄主植物根系释放萌发刺激物来诱导寄生植物种子萌发，寄生植物种子萌发后，形成的芽管沿着这些萌发刺激物浓度梯度朝向寄主根系生长，而接下来寄主化学信号诱导吸器的形成，实现与寄主的附着以及与木质部导管的连接(Matúšová et al., 2005)。目前普遍认为Strigolactones可诱导寄生植物种子萌发形成芽管(Sato et al., 2005)，而诱导吸器形成的化学物质主要有醌类、酚酸类、类黄酮等(Matúšová et al., 2005)。李天然等(1989)试验证明，肉苁蓉种子在无寄主的人工培养条件下用任何萌发刺激物处理均无萌发。本课题组研究发现温度与激素处理对肉苁蓉种子萌发形成芽管均有促进作用(张汝民等，2008)，醌类、简单酚类和酚酸类均可诱导形成吸器(表 6)。在10 μmol·L^-1浓度下DMBQ促进肉苁蓉种子吸器形成的作用最明显，而肉苁蓉种子对其他化学物质的敏感性低于DMBQ(表 6)。Chang等人最先(1986)从高粱(Sorghum vulgare)根中分离出DMBQ，可诱导独脚金(Striga asiatica)形成吸器，并指出甲氧酮(methoxyketone)是活性诱导物。Smith(1996)等发现对苯醌的诱导活性比DMBQ高出4倍，而本研究发现对苯醌不能单独诱导肉苁蓉种子形成吸器，而DMBQ效果较对苯醌要好。

3.3 化学物质酚醌类对肉苁蓉种子吸器形成的协同作用

Smith等(1996)认为醌类得到光化学刺激或NADH提供的一个电子后，形成半醌，半醌可进一步还原形成酚类，而当半醌将电子传给电子传递链的下一个受体时，半醌再重新氧化形成醌类。吸器形成的诱导因子可能是通过这一氧化还原机制传递电子来控制一些蛋白质和其他分子的活性(Keyes et al., 2001)。DMBQ、RS和FA处理能够诱导萌发的肉苁蓉种子形成吸器，吸器形成率较低(表 6)；DMBQ与RS和DMBQ和FA组合处理使萌发的肉苁蓉种子全部形成吸器(表 7)。DMBQ属于氧化性化学诱导物，RS和FA属于还原性化学诱导物，2类物质都存在的条件下，氧化性化学诱导物充当了电子传递链的电子受体，而还原性化学诱导物充当了电子传递链的电子供体，更有利于这一氧化还原机制发挥作用。因此，化学诱导物组合处理比单独化学诱导物处理对促进萌发的肉苁蓉种子吸器形成效果要强。自然状况下，梭梭根系分泌物中存在这几类化学诱导物(张汝民等，2006；2007)，充分说明肉苁蓉已经建立了一套精巧的机制来识别其寄主梭梭释放的这些异源识别物质。由此可见，肉苁蓉种子萌发寄生过程分2个阶段，植物激素诱导肉苁蓉种子萌发形成芽管，进一步形成吸器还需要特定的化学诱导物。