山核桃(Carya cathayensis)是我国特有的优质干果和木本油料树种(张若惠等，1979)，山核桃本砧嫁接一直是个难题，影响了良种化进程(黎章矩等，1992)，为此，林业工作者对山核桃嫁接进行了大量研究(钱尧林等，1995；汪祥顺等，1997；章小明等，1999；王白坡等，2002)，取得了突破性进展。黄坚钦等(2001；2002)、黄坚钦(2002)、郑炳松等(2002)研究了接穗种类、嫁接时间、激素处理等对山核桃本砧嫁接成活的影响，使1年生长枝为接穗的本砧嫁接成活率达到90%以上。本文在此基础上，观察了山核桃本砧嫁接初期的愈伤反应，研究嫁接成活砧穗初期的显微和超微结构，丰富和完善山核桃本砧嫁接技术，同时为其他嫁接成活困难的树种提供依据。

1 材料与方法 1.1 材料

试验材料取自浙江林学院林木良种繁育基地，砧木为2年生实生山核桃，苗高80~120 cm，地径0.8 cm。穗条取自采穗圃，接穗长40~60 cm，粗0.5 cm以上。2007年4月20日嫁接，采用切接。嫁接当天(记0天)取样，嫁接后第1~10天，每天取样，此后第12，14，16天各取样1次，取样位置如图 1。

1.2 方法

电镜样品常温包埋参照付洪兰(2004)的方法制作。嫁接面附近分别削取砧穗薄切片，迅速投入4 ℃预冷的0.1 mol·L^-1(pH7.0)磷酸缓冲液配制的4%戊二醛溶液中固定。到实验室切取小块(规格：3 mm×1 mm×1 mm，图 2)，更换4%戊二醛溶液抽气固定15 min后置于4 ℃冰箱过夜。经磷酸缓冲液充分漂洗，1%锇酸溶液固定2 h，梯度浓度乙醇(50%，70%，80%，90%，95%，100%)脱水，过渡到纯丙酮，最后用Spurr环氧树脂渗透、包埋。部分样品用LKB半薄切片机切片，横切，亚甲基蓝染色，加拿大树胶封片，Olympus光学显微镜观察、记录。部分样品定位后用Reichart-Jung ULTRACUT E型超薄切片机切片，横切，经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，日本JEOL公司JEM-1230型透射电子显微镜观察、记录。

2 结果与分析 2.1 砧、穗愈伤反应的显微结构变化

山核桃嫁接愈合过程中最开始的愈伤反应是隔离层的消长变化。隔离层是由切削面上因嫁接刀切割受伤致死的细胞挤压而成的，经过了形成、加厚、解体、消失的过程。嫁接后第1~3天，切面内部细胞形态变化不大，接穗和砧木的切削面均可看到染色较深的1个薄层，即为隔离层(图版Ⅰ-1)。此后，隔离层逐渐增厚，至嫁接后第6天，砧木和接穗的形成层均已开始明显活动，细胞层数增加到6~7层，切口处部分形成层细胞明显膨大(图版Ⅰ-2)。嫁接后第7天开始，砧木和接穗切口处及以内形成层区域的细胞旺盛分裂，体积膨大，失去原有的形态特征，呈现多边形或近圆形，并向外突起，从而使削面明显隆起，此时削面附近形成层区域细胞层数仅3~4层(图版Ⅰ-3)。此后，砧木和接穗形成层区域愈伤组织大量分裂增生，普遍增大，细胞层数增加到8~10层，部分愈伤组织细胞已经突破隔离层。至嫁接后第12天，砧木和接穗形成层区域已形成大量的愈伤组织细胞，并沿着与削面垂直的方向分化(图版Ⅰ-4)。此后，愈伤组织细胞继续分裂增生，形成旺盛的分生细胞团(图版Ⅰ-5)，韧皮薄壁细胞也产生大量的愈伤组织细胞(图版Ⅰ-6)。

图版说明  CaC：愈伤组织细胞；CW：细胞壁；CZ：形成层带；ER：内质网；G：高尔基体；M：线粒体；MB：多泡体；P：质体；PB：壁旁体；Ph：韧皮部；Pl：胞间连丝；S：淀粉粒；V：液泡；Xy：木质部。

Explanations of plates  CaC：Callus cell；CW：Cell wall；CZ：Cambium zone；ER：Endoplasmic reticulum；G：Golgi body；M：Mitochondrion；MB：Multivesicular body；P：Plastid；PB：Paramural body；Ph：Phloem；Pl：Plasmodesma；S：Starch granule；V：Vacuole；Xy：Xylem.

2.2 砧、穗嫁接愈伤反应的超微结构变化

山核桃嫁接后，接穗与砧木的切面细胞均表现出强烈的愈伤反应。嫁接面两侧受损伤的细胞受到创伤的直接刺激，愈伤反应活跃，发生一系列变化。

嫁接后前3天，切面细胞因切割破损，使形成层切口1~3列细胞受到直接创伤刺激，线粒体大量增加(图版Ⅰ-7)，部分细胞原生质体逐渐降解或缺失，部分细胞壁破裂，残留的细胞物质挤压形成隔离层(图版Ⅰ-8)。外侧细胞的胞间连丝也随着原生质体的降解逐渐关闭和阻断(图版Ⅰ-9)。第3~4列形成层细胞也有显著变化，相邻细胞间解体的絮状原生质通过破裂的细胞壁相互融合(图版Ⅱ-1)。韧皮薄壁细胞及形成层带细胞可见多泡体和壁旁体等膜状结构(图版Ⅱ-2，3)，第4~5列形成层细胞形态良好，细胞质浓厚，分布数个小液泡，含有大量淀粉质体、线粒体、粗面内质网及高尔基体等细胞器(图版Ⅱ-4，5)。

嫁接后7天，嫁接面第2~3列形成层细胞全部坏死，残留的原生质体明显减少，并与挤靠在一起的细胞壁一同构成较薄的隔离层。与隔离层毗邻的细胞仅含少量原生质，并被中央大液泡挤向壁周分布。第4~5列细胞愈伤反应强烈，胞间连丝间进行活跃的物质交换与运输，胞间连丝附近可见大量内质网(图版Ⅱ-6)。

嫁接后10天，嫁接面部分愈伤组织细胞体积增大，冲破隔离层。隔离层内侧第4~8列细胞显著膨大并液泡化，挤毁部分相邻细胞。在其质膜、胞间连丝附近可见大量膜状结构，呈多泡体状(图版Ⅱ-7)。内部细胞的质膜成波状起伏，局部形成明显袋状，内含小泡(图版Ⅱ-8)。

至嫁接14天以后，韧皮部嫁接面愈伤组织大量发生，已突破隔离层，其细胞与削面垂直方向排列，而内部细胞的原生质呈一薄层贴壁，可见淀粉质体和少量其他细胞器(图版Ⅱ-9)。嫁接面切口内3~8列细胞高度液泡化，细胞质内含有少量质体和内质网，靠近质膜处可见多泡体结构(图版Ⅱ-10)。

至嫁接后16天，嫁接面以内第3至多列形成层细胞，细胞壁很薄且多处断裂，多个细胞之间絮状的原生质体相互凝聚，融合(图版Ⅱ-11)。其内部形成层带细胞结构较完整，细胞壁薄，细胞质较浓，含有较多小液泡和质体，质体上几乎无淀粉粒可见(图版Ⅱ-12)。

3 结论与讨论 3.1 隔离层的消长及其作用

隔离层出现于所有创伤表面，是创伤后暴露面的一种普遍性反应(崔克明，2007)。山核桃嫁接后，切面细胞表现出强烈的愈伤反应，接穗与砧木的接触面上首先形成隔离层，它由嫁接面上创伤致死的细胞紧靠一起构成。隔离层的成分通常有强烈还原作用，嫁接初期分布在整个嫁接面上，它的出现可密封伤口，阻止细胞物质外渗，同时防止了病原菌及其他因素对嫁接体的伤害，起暂时的保护作用(赵红玲，2004)。隔离层又是动态变化的，首先山核桃的切口处第1列细胞因切割破损，细胞原生质体降解，仅残留细胞壁和部分原生质。随后愈伤信号从切面不断向内部细胞传递。其内2~3列细胞继续逐渐降解、坏死并参与隔离层的形成，创伤致死的细胞残体和嫁接面两侧活细胞的分泌物导致隔离层果胶质等多糖类物质积累，从而使隔离层逐渐增厚。当嫁接成功后，随着嫁接面两侧愈伤组织细胞分裂增生的机械压力和吸收作用，其隔离层中的内含物分散并逐步消失，隔离层逐渐变薄并被突破最终消失，从而使接穗和砧木间的愈伤组织得以直接接触。在本试验中，韧皮薄壁组织区域隔离层的突破和消失要较形成层的略早。

3.2 壁旁体的发生及其在嫁接愈伤反应中的作用

壁旁体是在细胞壁和质膜之间出现的囊泡结构，由许多球状和杆状的囊泡组成，常出现在胞间连丝附近。它与物质排出原生质体之外或与壁的代谢有关(韦存虚等，2002)。杨士杰(1985；1987)和杨士杰等(1988)在嫁接隔离层增厚和消失、壁物质增厚与消失过程的细胞中都观察到大量的小泡，多泡体和壁旁体，呈现活跃的囊泡运输现象，认为是与胞吞作用和胞吐作用有关的物质转移方式，可能起着共质体和质外体运输作用。

质膜向内凹陷，随细胞的液泡化其体积增大并积累物质，随后开口处的膜融合封闭并脱离质膜，最后被中央液泡吞噬消化或被围绕在其周围的内质网及其小泡消化而产生新的液泡。在不同液泡化的细胞中均有质膜内陷存在，逆境胁迫引起质膜的变化，受害严重的细胞，质膜离壁并形成许多皱褶，皱褶上往往有次生物质积累，使原来的膜加厚，电子密度增高。欧阳学智等(1996)观察到甜菊(Stevia rebaudiana)愈伤组织分生区域的细胞有质膜内陷存在。质膜呈起伏的波纹状，某些部位发生明显内陷，或内陷嵌入中央液泡，大小不等，多呈圆球状，内含物增多且结构复杂，以小泡和卷绕的膜结构形式存在。质膜内陷不仅加强分生细胞团物质运输和利用的功能，还提供了一个细胞外水解环境。在本试验中，山核桃嫁接后第3天(图版Ⅱ-2，3)，第10天(图版Ⅱ-7)，第14天(图版Ⅱ-10)等都可见大量壁旁体和多泡体等膜状结构，这与嫁接创伤后强烈的愈伤反应、增强的呼吸作用、旺盛的信息传递和物质交换密切相关。

3.3 嫁接愈伤的细胞学反应

山核桃嫁接后的愈伤反应在细胞学的变化上有以下几点：高尔基体、内质网、线粒体等细胞器数量显著增加，而后趋于正常水平，大量的多泡体、壁旁体出现，以及淀粉先积累后逐渐消失。线粒体数量的增加与嫁接后受伤细胞的呼吸作用加强密切相关，高尔基体与内质网数量的增加与多糖类物质在壁上的沉积及蛋白质合成速度的提高有关。通常嫁接后1周，内质网恢复正常。淀粉粒的积累也是嫁接后细胞脱分化过程必然出现的现象。这与杨世杰(1985)和杨世杰等(1988)的研究结果基本一致。

胞间连丝是植物体的一种超细胞结构，它把一个个相对独立的细胞转变成相互连接的共质体，为植物体的物质运输和信息传递提供了一个直接的从细胞到细胞的细胞质通道(简令成等，2003)。它能支持矿质离子、糖、氨基酸和有机酸等小分子物质，蛋白质和核酸等大分子物质(Mezitt et al., 1996；Ghoshroy et al., 1997)，以及原生质、染色质及细胞核(Ding，1998；Jian et al., 2005)等物质的胞间迁移。胞间连丝也是一种高度动态的结构，胞间连丝通道受控于ATP依赖的磷酸化，可以变化口径大小。山核桃嫁接后，切面破损细胞原生质迅速降解，流失，细胞残留物质紧贴细胞壁，切口的胞间连丝迅速关闭，阻断了内侧细胞原生质体的进一步流失。而内层的细胞之间胞间连丝则十分丰富，并呈现活跃的物质交换活动。这不仅阻止了原生质体的过度向外流失，而且加强了内部细胞之间的信息传递与物质交换，有利于嫁接后的成活。

山核桃嫁接后，不同时期隔离层以内均有不同程度的细胞壁自溶、细胞融合现象出现，很有可能与加快细胞的分裂，遗传物质的整合与交流有关。朱培坤等(1985)认为，嫁接时由于切伤造成接穗与砧木部分细胞原生质的衰老和降解，衰老的原生质可能向充满活力的细胞“逃命”，加剧细胞核和原生质穿壁运动，并认为嫁接的本质就是某种意义上的植物体细胞融合和遗传物质在细胞间的交流。Ohta(1991)对辣椒(Capsicum annuum)砧木茎段的组织学分析表明，木质化和死细胞中呈现不同大小和形状的染色质通过细胞壁和细胞间隙向维管束运动，并认为，嫁接切伤导致接穗和砧木细胞的原生质衰老和降解，降解的原生质可能整合到分裂旺盛的细胞中。刘明志(1998)用电镜观察科间离体嫁接细胞相互作用时，发现相互接触的2种异质细胞的质膜、核膜和线粒体膜的消失以及异质细胞壁变薄解体等，因而认为细胞解形后可能发生细胞重建。至于细胞融合的生物学意义还有待进一步研究。